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dna甲基化检测原理及方法？

dna甲基化检测原理及方法？

最佳答案DNA甲基化是重要的表观遗传修饰，它涉及到DNA分子上甲基基团的加入。甲基化在基因组稳定性、基因表达调控以及细胞分化和发育等过程中起着关键作用。

DNA甲基化的检测原理主要基于两种方法：甲基化特异性酶切和甲基化特异性结合。

1、甲基化特异性酶切：该方法利用DNA甲基化与未甲基化DNA的敏感性差异，通过特定的限制性内切酶进行酶切反应。未甲基化DNA序列容易被酶切，而甲基化的DNA则不易受酶切。然后，通过聚合酶链反应PCR或者核酸杂交等方法来检测酶切产物，从而确定DNA区域的甲基化状态。

2、甲基化特异性结合：该方法利用DNA甲基化与未甲基化DNA序列的化学结构差异，使用甲基化特异性蛋白质或甲基化特异性抗体与DNA结合。这些蛋白质或抗体可以识别并结合甲基化的DNA区域，然后通过免疫沉淀、荧光等方法来检测甲基化的DNA序列。

常用的DNA甲基化检测方法包括：甲基化特异性PCR（MSP）、全基因组甲基化测序（WGBS）、甲基化敏感限制性内切酶联PCR（MSRE-PCR）、甲基化特异性聚合酶链反等。

DNA甲基化检测方法主要利用DNA甲基化与未甲基化DNA在物理性质或化学性质上的差异，通过特定的实验操作和分析手段，以确定DNA序列的甲基化状态。这些方法在生物医学研究和临床诊断中发挥着重要作用。

DNA甲基化测序数据处理（一）：数据比对

最佳答案因为组里面出了一批甲基化测序数据，使用的技术为BS-seq，处理的时候顺带记录了学习过程，演示使用数据为官方提供的example.fastq。

DNA甲基化作为基因组上的表观修饰（区别于组蛋白修饰），存在于各种生物中。

虽然CpG序列出现的频率并不高，但是在某些基因区域内，CpG的密度很高，俗称CpG岛。这些CpG岛大多出现在基因的启动子区域（人类占到70%），长度达300-3000bp。目前的研究表明，大多数的管家基因都含有CpG岛，位于基因的5'端（其中的大多数CpG岛都是未甲基化的）。

另外需要注意的是，目前的研究表明， 肿瘤样本 与正常样本的CpG岛甲基化差异大多不是发生CpG岛的内部而是位于 CpG岛岸（CpG island shore） 。

由于CpG位点的易甲基化导致胞嘧啶脱氨变成胸腺嘧啶，所以在漫长的进化过程中，CpG位点逐渐消失，但是又存在着对于基因表达的调控要求，所以CpG岛的出现也被理解为抵抗甲基化经常很，维持调控功能。

此处略过，请自行了解(示例文件为WGBS单端测序文件)。

Bismark官网

需要用户已经装好bowtie1/bowtie2

此处使用测试数据 test.fastq

（from SRR020138, Lister et al., 2009; trimmed to 50 bp; base call qualities are Sanger encoded Phred values (Phred33)).

--cytosine_report 参数会根据当前目录下的信息文件生成一个HTML格式的报告文件，即 test_data_bismark_bt2_SE_report.html 文件，它包括了比对信息，甲基化信息，M-bias等，可以对数据有一个大概的认知（下图只展示了一部分）：

同时因为使用了 --comprehensive ，所以结果合并正反链的数据后会输出CpG/CHG/CHH三种类型的甲基化文件，包含了胞嘧啶所有的组合形式，但实际上我们自然最关注的是CpG位点的甲基化。其中

CpG_context_test_data_bismark_bt2.deduplicated.txt 即CpG甲基化位点的文件。

test_data_bismark_bt2.deduplicated.bismark.cov 文件则给了每个位点的甲基化比例，为下一步确定CpG岛提供了基础，其数据形式如下：

test_data_bismark_bt2.deduplicated.CpG_report.txt.CpG_report.txt 文件则是背景信息：

此处根据测序数据得到了甲基化位点的信息，但是后续DML以及DMR的确定还需要R包的使用，以及后续的可视化还以探索以下包：

DNA甲基化测序方法介绍

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DNA 甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。

DNA 甲基化及CpG岛

DNA 甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,可能存在于所有高等生物中。DNA 甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶。DNA 的甲基化是在DNA 甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶转变为5'甲基胞嘧啶。这种DNA 修饰方式并没有改变基因序列，但是它调控了基因的表达。脊椎动物基因的甲基化状态有三种：持续的低甲基化状态,如管家基因；去甲基化状态,如发育阶段中的一些基因；高度甲基化状态,如女性的一条失活的X染色体。

哺乳动物中，CpG序列在基因组中出现的频率仅有1%，远低于基因组中的其它双核苷酸序列。但在基因组的某些区域中，CpG序列密度很高，可以达均值的5倍，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，形成所谓的CpG岛。通常，CpG岛大约含有500多个碱基。在哺乳动物基因组中约有4万个CpG岛，而且只有CpG岛的胞嘧啶能够被甲基化，CpG岛通常位于基因的启动子区或是第一个外显子区。健康人中，CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲基化状态，而在CpG岛外的CpG位点则通常是甲基化的。这种甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定的保留。当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，而CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，以致于染色体螺旋程度增加及抑癌基因表达的丢失。

随着高通量测序技术（NGS）技术的发展，使我们能够从全基因组水平来分析5’甲基胞嘧啶及组蛋白修饰等事件，由此能够发现很多传统的基因组学研究所不能发现的东西，这就是所谓的“DNA甲基化测序”！

DNA甲基化测序方法按原理可以分成三大类：

一、重亚硫酸盐测序；

二、基于限制性内切酶的测序；

三、靶向富集甲基化位点测序；

基于原理又有数种不同的测序方法，下面，就介绍10种DNA甲基化测序的常用方法及参考文献：

1) 重亚硫酸盐测序

该方法可以从单个碱基水平分析基因组中甲基化的胞嘧啶。首先，利用重烟硫酸盐对基因组DNA进行处理，将未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基变成尿嘧啶。而发生了甲基化的胞嘧啶未发生脱氨基，因而，可以基于此将经重亚硫酸盐处理的和未处理的测序样本进行比较来发现甲基化的位点。

【相关文献】

Shotgun bisulphite sequencing of theArabidopsis genome reveals DNA methylation patterning

Highly integrated single-base resolutionmaps of the epigenome in Arabidopsis

2）重亚硫酸盐处理后接头标记技术(PBAT)

为了避免重亚硫酸盐处理时模板的丢失，通常会在重亚硫酸盐处理后进行接头连接和随机引物的扩增。

【相关文献】

Amplification-free whole-genome bisulfitesequencing by post-bisulfite adaptor tagging

3）限制性内切酶-重亚硫酸盐靶向测序(RRBS)

该技术是指对基因组上CpG岛或CpG甲基化较密集的区域进行靶向测序。样本首先经几种限制酶进行消化处理，然后经重亚硫酸盐处理，最后再测序。这种方法可以发现单个核苷酸水平的甲基化。

【相关文献】

Reduced representation bisulfite sequencingfor comparative high-resolution DNA methylation analysis

4）氧化-重亚硫酸盐测序(oxBS-Seq)

5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)是5’甲基胞嘧啶脱甲基成胞嘧啶过程的中间产物，重亚硫酸盐测序无法对二者进行区分。通过氧化-重亚硫酸盐测序，5’甲基胞嘧啶保留，而5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)被氧化，进而脱氨基成尿嘧啶。通过将经过氧化处理和未处理的样本进行测序比较，即可从单个碱基水平分辨5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)和5’甲基胞嘧啶。

【相关文献】

Quantitative sequencing of 5-formylcytosinein DNA at single-base resolution.

5）TET辅助的重亚硫酸盐测序(TAB-seq)

TAB-seq采用葡萄糖亚胺与5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)作用来保护免受TET蛋白的氧化。5’甲基胞嘧啶和未甲基化的胞嘧啶被脱氨基成尿嘧啶，进而可以从单个碱基水平鉴定5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)。

【相关文献】

Base-resolution analysis of5-hydroxymethylcytosine in the Mammalian genome

6）甲基化敏感性的限制酶测序(MRE-Seq)

MRE-Seq将甲基化作用的敏感性和限制酶的特异性结合起来进而鉴定CpG岛的甲基化状态。

【相关文献】

Genome-scale DNA methylation analysis

7）HELP-Seq

HELP-Seq采用HpaII及其甲基化不敏感的限制性内切酶MSPI处理，来对基因组内及基因组间的甲基化位点进行比较，进而实现甲基化测序。

【相关文献】

Comparative isoschizomer profiling ofcytosine methylation: the HELP assay

8）甲基化DNA免疫共沉淀测序(MeDIP)

MeDIP是一种采用抗体或甲基化DNA结合蛋白来捕获富集甲基化DNA的技术，这种技术可以发现基因组中高度甲基化的区域，如CpG岛，但不能进行单个碱基水平的分析。

【相关文献】

Chromosome-wide and promoter-specificanalyses identify sites of differential DNA methylation in normal andtransformed human cells

9)甲基化结合域捕获技术(MBD-CAP)

MBD-CAP技术利用甲基化DNA能够结合蛋白MeCP2,MBD1-2 和 MBD3LI来对甲基化的DNA进行免疫沉淀。与MeDIP技术相似，该技术也是可以发现基因组中高度甲基化的区域，不能从单个碱基水平分析甲基化。

【相关文献】

High-resolution mapping of DNAhypermethylation and hypomethylation in lung cancer

10）基于探针的靶向富集技术

甲基化测序靶向富集技术采用合成寡核苷酸探针来捕获CpG岛、基因启动子区域以及其他一些显著性甲基化的区域。目前，Agilent 和 Roche Nimblegen公司已有这种商品化的试剂盒。

最后，Pacific Biosciences（Pacbio）公司的这项SMRT DNA测序技术采用动力学原理来直接检测甲基化的胞嘧啶。

其中三代测序技术针对真核中的5mc检测需要的深度较深，大概要250x,但是利用特殊的试剂会降低其深度。

DNA甲基化测序数据处理（二）：差异分析

最佳答案衔接上一篇数据比对后的结果，使用R包DSS进行处理。

我们先来复习一下上一节课得到的数据结果：

*.bismark.cov.gz 文件

这里我们使用的R包为DSS，使用 Bioconductor 进行安装。

这个包可以对甲基化数据做两件事：

DSS包对差异甲基化的检测基于β负二项分布的严格沃尔德检验。

输入数据的格式如下:

DML是甲基化差异位点，DMR为甲基化差异区域。

使用DSS包自带的数据进行演示

1. 载入两个包DSS和bsseq（需要该包构建obj对象）

2. 利用DMLtest函数call DML，分为一下几个步骤：

根据甲基化水平进行loci的差异分析

3. 根据dmlTest来call DML

当然，用户也可以指定差异的阈值，只有差异大于阈值的才会被call出来。

4. 根据dmlTest Call DMR

我们可以发现，smoothing前后得到的结果差异还是很大，所以针对不同的实验类型我们需要注意是否使用smoothing。

同理，也可以使用的delta参数以及调整p.threshold得到合适的结果。

5. 可视化

DSS包提供了一个不是很美观的可视化函数，用户其实可以使用coverage结果在R里面作图。

分析到此就告一段落了，随后就是自行对差异甲基化区域的注释以及可视化文献作图。

后续在处理数据的时候，发现有一个情况，多核跑DMLtest会报错，详情解决方案可见

以下为简单解决方案

甲基化的甲基化检测方法

最佳答案DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。

1、甲基化特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。

2、亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。

3、高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting，HRM）

在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化（图1）。

其中，样品要求：细胞（≥106 个）、组织（≥300mg）、血液（≥1ml）、血清（≥1.5ml）等样品材料，基因组DNA（体积≥20μl，浓度≥50 ng/μl）。

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