导读甲基化水平计算方法答单个位点的甲基化水平＝支持甲基化C的reads数/总的reads数计算得到单个位点的甲基化水平后，用 二项分布 检验判断某位点是否为甲基化C位点。对于某个区域的甲...

今天运困体育就给我们广大朋友来聊聊江西甲基化差异,希望能帮助到您找到想要的答案。

甲基化水平计算方法

甲基化水平计算方法

答单个位点的甲基化水平＝支持甲基化C的reads数/总的reads数

计算得到单个位点的甲基化水平后，用 二项分布 检验判断某位点是否为甲基化C位点。

对于某个区域的甲基化水平计算方法，不同的方法会得到不同的结果。

即：甲基化C占区域内所有覆盖到的C位点的比例

即:所有C位点的平均甲基化水平，区域内所有甲基化的C的单个位点甲基化水平之和/区域内所有覆盖到的C位点的个数

即：加权甲基化水平，区域内所有甲基化C位点总的reads数/区域内总的覆盖度

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甲基化水平异常是什么意思

答指DNA分子上的甲基基团数量和位置的变化。甲基化是一种化学修饰，通过在DNA分子上添加甲基基团来改变基因的表达，这种修饰可以在基因的启动子区域或其他区域发生，从而影响基因的转录和翻译，因此，甲基化水平异常是指DNA分子上的甲基基团数量和位置的变化。

文献精读 | 基因组6mA修饰相关文章解读及部分分析重现

答Zhu S , Beaulaurier J , Deikus G , et al. Mapping and characterizing N6-methyladenine in eukaryotic genomes using single molecule real-time sequencing[J]. Genome Research, 2018, 28(7):gr.231068.117.

Xiao C L , Zhu S , He M , et al. N6-Methyladenine DNA Modification in the Human Genome[J]. Molecular cell, 2018, 71(2).

简单来说，这篇文章从“华夏1号”的PacBio三代测序数据出发， 前6个results 介绍了PacBio测序寻找6mA修饰的精准度，并对基于二代测序的6mA-IP-seq，基于质谱的LC-MS/MS，以及基于qPCR的6mA-IP-qPCR和6mA-RE-qPCR等方法进行验证和补充说明，结论是基于二代测序的6mA-IP-seq能够得到的6mA修饰位点在SMRT的数据中都有，但是位点要显著少于SMRT测序数据能找到的6mA位点。 Result-7和Result-8 分别介绍了基于猜想寻找人类系统中6mA修饰的甲基化和去甲基化酶，分别是N6MT1和ALKBH1。这里主要是进行了一系列细胞水平的过表达或者干扰/敲除实验，以及体外甲基化实验。首次鉴定了人类基因组6mA修饰的甲基化酶——N6AMT1。最后两个 结果9和10 主要是粗略研究了一下一小部分gastric cancer 和liver cancer病人中的6mA修饰情况以及N6AMT1/ALKBH1的表达情况，得出 癌组织比癌旁组织的6mA修饰少 ， 值得注意的一点是，这篇文章当中，对癌和癌旁组织中的6mA进行检测用的方法是免疫组织化学（IHC），而不是测序的方法 。并且发现6mA修饰水平和预后有关。通过对肿瘤细胞系做N6AMT1和ALKBH1过表达、沉默实验发现6mA修饰水平的高低会影响肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等表型。

个人觉得这篇文章值得参考的地方是利用PacBio的测序数据去提取修饰信息的Bioinformatics分析部分。

Cell. 2018 Nov 15;175(5):1228-1243.e20. doi: 10.1016/j.cell.2018.10.006. Epub 2018 Nov 1 N6-methyladenine DNA Modification in Glioblastoma.

我个人感觉 这篇文章思路比较迷 （也许应该说比较丰富，所以一遍读不明白），发表于第二篇文章之后，出现很多有意思的，与第二篇文献的结论完全相反的结果。在看了Author Contribution之后我的感觉更加强烈——即这篇文章应该是两个竞争课题组后来整合成果共同发表为一篇文章的套路。（只是猜测，不一定对哈）由于相对来说这篇文章比肖传乐的文章更复杂，所以在附上完整思路整理图的同时，我对单个result进行拆分梳理如下。前三个结果主要谈论的是N6-mA修饰；后三个结果主要谈论的是ALKBH1这个基因。

首先是 背景 ，值得一说的是为什么作者选择了神经胶质母细胞瘤（Glioblastoma）来研究DNA的6mA修饰。Glioblastoma是一种发病率很高，并且很具侵略性的原发性脑肿瘤， 这个癌种被证明有广泛的表观遗传修饰失调 ，例如DNA 5mC的高甲基化、染色质重塑酶基因如EZH2和BMI1的表观修饰变化。然后作者们就选择了用来自病人的胶质母细胞瘤细胞对DNA 6mA修饰及其功能进行研究。

这部分主要用dot blot, MS和免疫细胞荧光(ICC)三种技术对Glioblastoma病人衍生的干细胞GSCs和两个primary tissues进行研究(primary tissues只做了dot blot)，然后发现 在GSCc和primary tissues中的6mA修饰都比human astrocytes (人类形形胶质细胞，作为normal control)中要高。这个结论与第二篇肖传乐等人的文章中得出的‘normal组织中的6mA修饰水平更高’刚好相反 。

这个部分主要是对两个GSCs细胞系和一个primary组织进行了N6-mA DIP-seq测序。分析测序结果发现(1) 每个样本能检测到7,282-17,263个N6-mA peak, 这一结果与2018-molecular cell上发表的肖传乐等人的文章中用的6mA-IP-seq在HuaXia1基因组中检测到的(21,129)？ (2) 每条染色体上都检测到了N6mA，其中7号染色体、19号染色体和21号染色体上最多； 而关于分布的染色体的特征，肖传乐等人的文章似乎表示6mA在常染色体上的分布是比较均一的？ (PS: 在文章中进行了Genome Background比较得出的这个结论，由于我是生信菜鸟，我不太懂，希望有专业人士可以指导一下~)(3) GO富集分析发现m6A修饰的基因主要富集在神经发生和神经发育通路；(4) motif分析发现6mA的常见修饰寡核苷酸是GGAAT，肖传乐等人的文章中得到的motif是[G/C]AGG[C/T] 。

作者提出 “N6mA是一种抑制性的表观修饰” 。怎么说呢，因为在Result-2中鉴定到的富含6mA修饰的DNA motif- GGAAT-是人类大部分微卫星重复序列的结构，而人类微卫星重复序列主要在异染色质区域。所以Result-3就开始探索N6mA与异染色质之间的关系。首先对Result-2部分的三个样本进行了H3K9me3，H3K27me3和H3K4me3的ChIP-seq，发现80%的N6-mA的峰能和异染色质marks，即H3K9me3, H3K27me3重合。之后又对387这个GSC做了WGBS (全基因组甲基化测序)，发现有轻微差异。（小声：连显著性都没标是不是因为没有显著差异，23333）

这个结果部分首先对ALKBH1这个基因进行体外和体内实验，均证明能影响6mA的量； 最重要的是，这篇文章也做了N6AMT1这个基因，通过CRISPR构建N6AMT1敲除的细胞系的6mA修饰水平没有发生变化。体外的实验也没有变化。这里有几个地方我个人认为比较不明确：首先，做CRISPR-Cas9敲除的GSCs细胞系未告知明确是哪个；然后做dot blot的DNA用量也没有标明。因此不能和肖传乐等人的文章进行更精确的比较。

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还有不解的是：后面他们先是做了CRISPR敲除ALKBH1基因的细胞系，然后去做了RNAseq，得到表达变化了的差异基因；然后他们用shRNA干扰ALKBH1表达的细胞做N6-mA DIP-seq去找ALKBH1被knockdown之后N6mA修饰发生改变的位点，然后比较ALKBH1被敲除后表达下调的基因的N6-mA的修饰的变化情况。为什么不直接用ALKBH1-KO的细胞系做N6-mA DIP-seq呢？关键是他文写的还是'after ALKBH1 deleption'？感觉略混乱啊

继续‘震惊’的是，他们又做了ATAC-seq，发现ATAC-seq的峰刚好和N6-mA DIP-seq的峰呈负相关。这思路真(kan)清(bu)奇(dong)。难道前面不是已经证明了N6-mA喜欢在异染色质区域吗？异染质区域难道不是开放性弱的区域吗那么不是理论上就是在ATAC-seq不能拉到的区域吗

然后，为了搞明白ALKBH1到底是怎么去掉N6-mA修饰的，他们做了ALKBH1 pull-down实验。发现ALKBH1喜欢跑到带有N6-mA修饰的寡聚核苷酸那里去为了解释这种现象，他们又做了ALKBH1的ChIP-seq。然后发现ALKBH1 ChIP-seq的峰和N6mA的峰重叠然后得到的结论是：ALKBH1是一个转录因子，它跑到N6-mA富集的地方去并且移除N6-mA修饰的抑制作用思路绕吗可能CNS级文章就是这样吧

第五个结果比较简单，但是到了第五个结果这里，ALKBH1, Histone modification (eg, H3K9me3), N6-mA modification和Gene expression这4者之间的关系其实相对来说似乎就明朗了。

(1) ALKBH1升高会减少N6-mA的修饰；

(2) N6-mA修饰减少会去掉基因表达的抑制性修饰，所以理论上来说正常组织中带有较多N6-mA修饰的基因在ALKBH1表达升高之后它们的表达也会升高，即ALKBH1的水平与基因表达呈正相关；

(3) N6-mA修饰与H3K9me3的修饰peaks高度重叠 ；

所以在第五个结果里，通过对ALKBH1 knockdown的细胞系做H3K9me3 ChIP-seq，弥补上了ALKBH1与H3K9me3的关系。本文的研究结果是： 检测到ALKBH1 knockdown的细胞系基因组中有更多H3K9me3 peaks，因此认为ALKBH1可以调控组蛋白修饰的形成。

这篇文章内容很丰富，思路很丰满，太累了。后面主要是设计了相对完整的对照实验做RNAseq等实验证明N6-mA与缺氧调控通路的关系，以及去做了个ALKBH1敲除后的肿瘤细胞表型实验等。

Wu T P , Wang T , Seetin M G , et al. DNA methylation on N6-adenine in mammalian embryonic stem cells[J]. Nature, 2016.

Yao B , Cheng Y , Wang Z , et al. DNA N6-methyladenine is dynamically regulated in the mouse brain following environmental stress[J]. Nature Communications, 2017, 8(1):1122.

这篇文章的第二个结果，通过6mA-IP-seq测了3对stress/control鼠脑PFC区的6mA变化，得到主要变化——不论gain 6mA还是loss-of 6mA都是发生在intergenic基因间区。当关注基因内的6mA变化时，发生主要是发生在introl区。

而2018-Moleculer Cell-肖传乐等人的文章的结果是6mA在基因内intragenic的修饰区域主要是在exon区。

在第四个结果里，通过对RNAseq的数据进行分析，并且结合6mA-IP-seq数据，把所有基因分为以下四类：① gain-of-6mA/upregulated; ② gain-of-6mA/downregulated; ③ loss-of-6mA/upregulated; ④ loss-of-6mA/downregulated。GO分析之后发现只有第③类loss-of-6mA/upregulated的基因能够富集到与神经发育及功能相关的通路上。

Liu J , Zhu Y , Luo G Z , et al. Abundant DNA 6mA methylation during early embryogenesis of zebrafish and pig[J]. Nature Communications, 2016, 7:13052.

这篇文章比较短，只有7页pdf，接下来按照文章给出的result来理一下整个项目的思路。

首先第一个结果部分 (1) DNA 6mA modification during early embryogenesis of zebrafish ，作者主要利用UHPLC-QQQ-MS/MS超高分辨率-三重四级杆-串联质谱，以斑马鱼为模型，非常细致地研究了斑马鱼的精细胞、卵子、早期胚胎发育的各个细胞时期（受精卵、2细胞、4细胞、8细胞、16细胞、32细胞、64细胞、128细胞、256细胞、512细胞时期）以及成年斑马鱼的不同组织器官（包括脑、眼睛、心脏、卵巢、精囊、肌肉和肠）进行了6mA丰度研究，平均每一个实验组需要约10,000个细胞提取的基因组DNA。结果表明精细胞中6mA/A的比例约在0.003%，卵母细胞中约为0.015%；在32-64细胞时期6mA/A的比例达到最高，约为0.1%，之后慢慢下降，直至回归原始基因组水平。

同时成年斑马鱼的不同组织器官中6mA/A的丰度也是符合一般水平，无明显变化。

甲基化指数7是什么意思

答患癌风险高。甲基化指数为7属于高风险指数，做肠镜的检查，有可能会出现肠炎或者是肠癌等现象，患癌风险高。所以最好检查清楚之后再进行治疗，要多注意观察身体的健康情况，注意饮食清淡。甲基化指数是用数字把甲基化程度具体表现出来，甲基化指数中位值为0.6，甲基化指数高，有高危前病变细胞的可能性。

甲基化知识点

答所以首先需要搞清楚什么是表观修饰，表观遗传学，以及为什么关注DNA甲基化这其中一种表观修饰！

表观遗传修饰是指对基因组功能的相关修饰，通过一系列生物学修饰改变基因的活性而不是DNA的核苷酸序列影响基因的表达。对基因组功能的相关修饰主要包括对**DNA、RNA、以及组蛋白等的修饰，这些修饰改变了染色质的局部电化学特性和构象，从而调节基因的转录活性。

其中对 组蛋白修饰 主要是究方法通常是chip-seq技术，我们已经在生信技能树发布了系统性的chip-seq教程，这里就不再赘述。组蛋白是染色质的重要组成部分，主要分为H2A、H2B、H3、H4，与DNA缠绕可形成核小体。 组蛋白修饰 是在组蛋白N末端的氨基酸残基上发生的共价修饰，主要包括甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化、羰基化、糖基化等。

DNA甲基化 是表观遗传学领域一个重要的研究方向，真核生物中最常见的DNA修饰非 5-甲基胞嘧啶（5mC） 莫属了，然而在原核生物中最常见的DNA修饰方式则为 N6-methyladenine (6mA) ，即腺嘌呤第6位氮原子甲基化修饰。

人类是真核生物 ，所以当然是5mC的DNA甲基化形式的检测咯。人的参考基因组约30亿碱基，上面不到1%是 CpG位点，可以被甲基化，也就是说不到3千万个 CpG 位点。这些 CpG 位点中，大约 60~80% 被甲基化。主要是而启动子等特殊区域存在 未被甲基化的CpG 岛，那些区域的CpG 位点比较富集。目前研究表明，肿瘤细胞的甲基化水平平均是低于正常细胞的。

亚硫酸盐是甲基化探测的“金标准”，不管是芯片或者甲基化测序，都要先对DNA样品进行亚硫酸盐处理，使非甲基化的C变成U，而甲基化的C保持不变，从而在后续的测序或者杂交后区分出来。

关于DNA甲基化检测手段介绍，我觉得 Make Decision: DNA甲基化检测方法，哪一款适合你？ 写的就足够好了。同样的，早期研究以芯片为主，从成本的角度来看，也是芯片为主，但是测序数据更丰富。

可选的甲基化芯片产品就少很多，绝大部分是illumina公司产品的，从27K到450K到850K甲基化芯片。比较好的介绍是：Illumina 琪先生 2018-07-17的 一文了解 MethylationEPIC 850K 甲基化芯片

Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片包含了原先的Infinium Methylation450 BeadChip芯片90%的内容，这种选择可提供一种广泛、全面的甲基化组图谱。而且还靶定了ENCODE计划中确定为潜在增强子的区域，还有FANTOM5计划在各种组织类型中确定出的增强子。详细如下：

Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片的数据分析是由GenomeStudio Methylation Module模块所支持，让研究人员能够对小规模研究开展差异甲基化分析。GenomeStudio软件2011.1版特有高级可视化工具，让研究人员能够在单幅图中查看大量的数据，如热图、散点图和线图

甲基化检测方法多达上百种，哪怕是基于NGS的测序技术，也有BS-Seq、MeDIP-Seq、RRBS-Seq、WGBS、MBD-Seq、SMRT 等，我发现 何聪聪 诺禾科服 2016-09-10 介绍的比较齐全，摘抄送给大家，原文在： DNA甲基化研究方法速递

我们我们介绍甲基化测序数据的一般分析流程的时候，主要是针对WGBS技术的数据。

BS-Seq（亚硫酸氢盐测序）有两个缺点：

针对这两个缺陷，科研界一直在尝试研发改进方法。

复旦大学于文强教授团队开发出了一种新的全基因组检测的方法 GPS。该方法利用 T4DNA 聚合酶的 3′-5′外切酶活性和 5′-3′聚合酶活性，使得双端测序的一端是基因组原序列，另一端是转化后的表观序列。该方法极大提高了比对效率和准确性。

当然了，也是可以用低通量手段，专注 特异性位点甲基化检测 ，有：

比如发表在BMC Med. 2009 Oct 的文章Genomic and epigenetic evidence for oxytocin receptor deficiency in autism.里面Gregory等研究者通过 亚硫酸氢盐测序 的方法对119例ASD患者和119名健康人进行了DNA甲基化分析，分析了与调节OXTR表达相关的CPG在外周血和颞叶皮质的甲基化水平，发现ASD患者的CPG甲基化水平在外周血和颞叶皮质均较健康人明显升高。这个研究里面的bisulfite sequencing (BSS)就是低通量，仅仅是关注感兴趣的基因而已：

生物学意义，通常是建议大家看教科书吧，DNA甲基化是最早被发现的表观遗传修饰途径之一，参与许多重要的细胞过程，如基因组印记、X染色体灭活、转录抑制、胚胎发育等，与精神分裂症、Rett综合征、肿瘤等多种疾病的发生和发展密切相关。

尤其是我感兴趣的肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变，其特点是总体甲基化水平的降低与局部甲基化水平的升高。在肿瘤细胞中，癌基因处于低甲基化状态而被激活，抑癌基因处于高甲基化状态而被抑制。

比如： DNA甲基化与肿瘤风险预测

再比如： DNA甲基化推进脑肿瘤的精准分型

还有番茄，玉米的研究，大家自行检索深入学习哦。

当然，更值得一读的是2018年5月， Nature Reviews Molecular Cell Biology 发表的中国科学院上海植物逆境生物学研究中心 朱健康 研究员、 张惠明 研究员与 郎曌博 研究员共同完成的题为“Dynamics and function of DNA methylation in plants”的综述文章。 系统的讨论了植物中DNA甲基化过程。

人体内，DNA甲基转移酶主要有四种：DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L。

因为药物研发也不是我的领域，这里略~~~

随着高通量生物技术（芯片、测序技术）的不断更新发展，高通量的DNA甲基化数据不断涌现，一些大型国际合作的生物大数据计划产生了Pb（petabyte）数量级的甲基化谱。由多个国家和地区的研究机构组成的“国际人类表观基因组同盟”（International Human Epigenome Consortium，简称IHEC）为了研究与人类健康和包括癌症在内的复杂疾病相关的细胞状态产出了超过1000个表观基因组的数据

摘自：

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