导读生物检测新方法生物检测法包括：（1）生物毒性试验法。小鼠生物法是AOAC推广的检测麻痹性贝类毒素的标准方法，是国际上都能接受的唯一的方法。该方法在检测样本总毒性方面相当成...

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生物检测新方法

生物检测新方法

生物检测法包括：（1）生物毒性试验法。小鼠生物法是AOAC推广的检测麻痹性贝类毒素的标准方法，是国际上都能接受的唯一的方法。该方法在检测样本总毒性方面相当成功，但是无法准确定性样本中单个毒素。

此外，还有家蝇生物分析法、蝗虫生物分析法。上述3种生物分析技术原理相似。 （2）细胞毒性试验法。石房蛤毒素具有Na+通道阻滞剂的特性，可拮抗箭毒、藜芦碱的作用，以减少或“解救”细胞形态的改变及细胞裂解死亡，且该拮抗或“解救”作用与毒素的量呈对应关系。

根据该对应关系可以计算出毒素的含量。早期建立的方法是用显微镜计数活细胞数以检测PSP毒素的量，但试验时间长，操作繁琐，所需细胞量大。 在该原理之上发展起来一种STX的快速诊断装置MIST，已成功用于酸性粗毒中PSP总毒性的测定及STX、neoSTX、GTX和dcSTX相关毒性的测定，该装置的灵敏度高，检测迅速且无需组织培养的设备及专业知识。

（3）免疫分析技术。随着抗STX抗体的获得，免疫分析技术如血球凝聚反应、放射免疫分析（RIA）和酶联免疫分析（ELISA）等逐渐发展起来，其中直接竞争ELISA法是最常用的一种方法，检测限可达3pg/ml，间接ELISA的检测限也可达到10pg/ml。

免疫方法灵敏度高，方便迅速，但抗体的获得是其关键，各毒素的交叉反应低，不能完全体现样品的毒性来源。（4）受体分析法。即固相受体结合法（solid-phase receptor binding assay），主要是根据PSP毒素能与Na+通道蛋白质结合的特点，应用同位素标记以检测PSP类毒素的量，具有快速、可靠、准确的特点。

Llewellyn等以一种特异结合STX的类似转铁蛋白Saxiphilin代替Na+通道蛋白质，其对STX的鉴定具有专一性，从而与TTX的鉴定相区别。

中国药典和美国药典中的细菌内毒素检测法的不同点是什么？

1、细菌内毒素工作标准品（CSE）

CP：对CSE的用途及效价进行定义“细菌内毒素工作标准品中每1ng细菌内毒素的效价应不小于2EU，不大于50EU”

USP：未提到CSE

2、细菌内毒素检查用水

CP：与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37±1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水；

USP：与鲎试剂在限定的灵敏度下不发生反应的灭菌注射用水或其它水。

3、实验用具的准备

CP：实验所用器皿需经处理，除去可能存在的外源性内毒素，常用的方法是250℃下干烤至少1小时，也可用其它确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。

USP：使用经验证的除热原程序对所有玻璃器皿和遇热稳定的材料在热空气烘箱中进行除热原，常用的最低温度和最少的时间是250℃下30分钟。

4、内毒素标准品贮备液和标准品溶液的制备

CP：未提到

USP：RSE的效价定为10,000USPEU/支，用5ml鲎试剂检查用水复溶1支RSE的全部内容物，用漩涡混合器间歇混合30分钟，并用此原液作系列稀释，将原液置于冰柜中保存不超过14天，作以后的稀释之用，在使用前用漩涡混合器强力混合不少于3分钟，在作下一步稀释前需对前面的稀释液混合不少于30秒，不要贮存稀释液，因为没有数据能证明其不会因为吸附作用而失去活性。

5、供试品溶液的制备

CP：|某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提用LRW复溶或稀释药品或抽提医疗器械，某些物质可能更适于用其它水性溶液来溶解、稀释或抽提。

对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品需调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般要求供试品溶液的pH值在6.0-8.0的范围内。

USP：用LRW复溶或稀释药品或抽提医疗器械，某些物质可能更适于用其它水性溶液来溶解、稀释或抽提。

6、内毒素限值的建立

CP：药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M

L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg·h）表示，注射剂K=5EU/(kg•h)

放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg·h)，鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg·h)；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kg·h）、mg/(kg·h）或U/(kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62m2计算。

注射时间若不足1小时，按1小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M）。

USP：非经肠道药品的内毒素限值，以剂量定义，等于K/M

除了鞘内给药以外的任何给药途径，K均为5USP-EU/kg，鞘内给药时，K为0.2USP-EU/kg，对于非鞘内给药放射性药品，内毒素限值的计算为175/V，V为以mL为单位的最大推荐剂量

对于鞘内给药的放射性药品，其内毒素限值为14/V，对于按以每平方体表面积计算的给药剂量（通常是抗肿瘤药品），计算公式为K/M，其中K=5EU/kg，M为（最大剂量/m2/小时×1.80m2)/70kg。

7、灵敏度复核实验

CP：当最大浓度2.0λ管为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性时，实验方为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）：λc=lg-1(ΣX/4)

USP：|浓度最低的标准品溶液的所有重复管均为阴性，实验方为有效。

用下式计算终点浓度的对数值的平均值，然后再计算该平均值的反对数：终点浓度的几何平均值=antilog(Σe/f)

Σe是稀释系列的终点浓度的对数值之和，f为重复管数，反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的测定值。

8、凝胶法限量实验：

CP：溶液制备以添加了内毒素的溶液为“供试品溶液’。---USP：为“经稀释的供试品溶液。

CP：使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品液来制备溶液A和B。----USP；使用稀释倍数不超过MVD的稀释液来制备溶液A和B

CP：在复试中，溶液A需做4支平行管，当所有平行管都为阴性时，供试品溶液符合规定

------------USP：在复试中，如果溶液A的两支平行管均为阴性，供试品溶液符合规定

USP：如果供试品溶液以不超过MVD的某个稀释倍数稀释，检测结果为阳性时，可进一步稀释供试品溶液但不能超过MVD，再重新进行试验。------CP；无规定。

湖南永顺对公职人员进行毛发验毒，还有哪些验毒方法？

  网上新闻媒体报道了这样一则新闻，引发了大众的关注，这则新闻是湖南省永顺县对全县的公职人员进行了毛发验毒，如果一旦检测出这些公职人员中有吸毒的人员，立即开除其公职，据了解，目前，永顺县已经开除了六名公职人员。毒品的危害性极大，吸毒不仅仅是对自身身体造成伤害，对吸毒者的家庭，对社会都造成了极大的危害。以下介绍几种检测有没有吸毒的常规检测方法：

  验毒的方法有很多，比如尿液检测，毛发检测，血液检测，唾液检测，汗液检测等等。首先是尿液检测，这是最常见的检测方法，尿液检测是用毒品尿检试纸来检测人员有没有吸毒，这种方法方便，但是能检测的实践较短，主要用于初步筛查，如果用于检测的话，需要对测验人员进行长期监测。再者是唾液检测，不过这种方法的准备度并不是很准，据讲，这种方法一般用于路道的交警临时检测。

  还有毛发检测，毛发验毒检测的时间范围更长，可以检测半年左右的时间，主要用于社区戒毒所对戒毒人员检测或者对可能吸毒的怀疑对象进行检测。还有很多方法，这里就不一一赘述了。

   我们国家禁毒，公职人员就应该以身作则，不应该带头吸毒，永顺县的这个行为做的好，建议在全国范围内推广，并且不定期检测。这些年来，有多少缉毒警察为此丧命，我们国家为了禁毒做出了巨大努力，如果公职人员都开始吸毒，那么这些努力，这些牺牲的生命算什么。我们作为中国的公民，就应该支持国家，牢记历史教训，全面禁毒。杜绝毒品，从你我做起。

贝类毒素的检验方法

1 小鼠生物检测法

小鼠检测法是应用最多的贝类毒素检测方法，可用于所有贝类毒素的检测。该方法的优点是技术容易掌握，不需要使用专门仪器。小鼠生物检验法是将贝类毒素的提取物进行适当的稀释后，对小白鼠进行腹腔注射，并计算平均致死时间。根据Sommer表，查出相应的MU(给小白鼠腹腔注射毒素的系列稀释液，然后计算每只20g小白鼠的剂量作为1个死亡时间，以15min内杀死1只鼠单位<Mouse unit，MU>来表示毒性的大小，换算成MU/100g贝肉)。

小鼠生物测定法已被AOAC(美国公职分析家协会)作为国际海产品贸易中贝类麻痹性毒素的测定方法。但该方法的缺点是由于小鼠的大小以及小鼠个体情况的不同，因此造成灵敏度不高，偏差较大。而且存在实验小鼠用量大以及哺乳动物费用增加的缺陷。同时操作繁琐，以及用该法测定高毒性贝类样品时的变异性较高的缺陷[13]。因此需要一种新的测定方法来弥补小鼠检测法的不足。

2 高效液相色谱法

采用高效液相色谱(HPLC)等化学检测法测定贝类毒素发展很快。HPLC法主要应用于PSP， DSP和ASP的检验上[6]。与其它方法相比，HPLC法有着明显的优越性：(1)灵敏度高，专一性强，检出限低；(2)在酸性条件下不稳定的基团如氨甲酰基N)磺基在分析的过程中不会解离；(3)缩短了分析时间，通过自动注射技术，能处理更多的样品，便于进行毒素监控；(4)能提供关于毒素的更多信息，能测出每1个组分的具体含量及毒性的大小，从而有助于比较或了解毒素种类的差异。

HPLC法是唯一能定性、定量检测出各种毒素组分的技术，HPLC法发展非常迅速并极有可能代替小鼠检测法成为主要的检测方法。该法也存在一些如测定时需要昂贵的仪器、专业知识和费时等缺点。

3 免疫学测定方法

免疫学测定方法以抗原一抗体特异性反应为基础，其中包括凝集反应、沉淀反应、补体反应等。可用于PSP，DSP和NSP的检测，其原理是将兔子等实验动物暴露在毒素中，以功能性抗原刺激兔子产生抗体，然后从兔子的血清中提取抗体。抗体可用放射性或荧光物质标记。提取的贝类毒素或匀浆后的贝类组织(如贻贝)暴露于标记物中，然后检测抗血清一抗原混合物中放射性或荧光强度以测定样品中的毒素的含量。

4 细胞检验法

细胞检测法是建立在贝类毒素对生物细胞影响的基础上。许多实验已证明麻痹性贝类毒素的致病机理是通过对细胞钠通道的阻断，造成神经系统传输障碍而产生麻痹作用。

其实验原理如下：当加入乌本苷这种物质时，可增加钠的流入，此时小鼠的成神经细胞瘤扩张并最后溶解暴露在藜芦丁中。但在麻痹性贝类毒素存在时，这两种物质的作用可得到抑制，麻痹性贝类毒素通过对细胞钠通道的阻断，可使细胞形态保持完整。与麻痹性类毒素不同，腹泻性贝类毒素的细胞检验法是建立在肝细胞形态的变化基础上的。

5 其它检测方法

其它检测方法包括分光光度法，电泳法(最常用的是毛细管电泳，主要用于分离测定PSP毒素中的非衍生毒素)，薄层色谱法和气相色谱法(用来检验软海绵酸)等化学检验法，此外，还包括家蝇生物检验法，蝗虫生物检验法，神经细胞生物检验法(又称组织培养分析法，可用于PSP，ASP和DSP的分析的新方法)等生物检验法。

细菌内毒素检测

细菌内毒素检测方法分以下两种：

一、家兔热原法

由于家兔对热原的反应与人基本相似，家兔法为各国药典规定的检查热原的法定方法。

《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。

检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml,试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性 药物制剂。

二、鲎试剂法

细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。

鲎试剂法又称凝胶法，系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反立的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。

由于鲎试剂法简单﹑快速﹑灵敏﹑准确，已广泛用于临床、制药工业药品检验等方面。鲎试剂法检查内毒素的灵敏度为0.0001μg/ml,比家兔法灵敏10倍，操作简单易行，试验费用低，结果迅速可靠，适用于注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂，但其对革兰阴性菌以外的内毒素不灵敏，鲎试剂法尚不能完全代替家兔法。

中科检测开展细菌内毒素检测服务。

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