导读客户文章 | m6A去甲基酶FTO通过自噬抑制口腔鳞癌发展m6A是真核生物中最丰富的内源性mRNA修饰，在肿瘤发生中起着重要作用，然而，其内在机制仍不十分清楚。来自中山大学口腔医院的研...

今天运困体育就给我们广大朋友来聊聊陕西甲基化m6a全转录组测序,希望能帮助到您找到想要的答案。

客户文章 | m6A去甲基酶FTO通过自噬抑制口腔鳞癌发展

客户文章 | m6A去甲基酶FTO通过自噬抑制口腔鳞癌发展

m6A是真核生物中最丰富的内源性mRNA修饰，在肿瘤发生中起着重要作用，然而，其内在机制仍不十分清楚。来自中山大学口腔医院的研究团队在今年5月份在线发表了m6A修饰与口腔鳞状细胞癌（OSCC）相关研究成果[1]。研究者建立了雷帕霉素（rapamycin）诱导自噬的细胞模型来筛选m6A修饰酶，发现m6A去甲基化酶FTO通过靶向编码eIF4G1（真核细胞翻译起始因子γ1）的基因，在OSCC的自噬和肿瘤发生中起关键作用。敲除OSCC细胞系中FTO的表达，会导致eIF4G1的下调，同时增强自噬潮（或称自噬通量）和抑制肿瘤发生。雷帕霉素还会抑制FTO活性，直接靶向eIF4G1转录本，以m6A依赖方式介导其表达。双荧光素酶报告和突变实验证实，YTHDF2靶向eIF4G1。最后，在FTO沉默后，YTHDF2捕获含有m6A的eIF4G1转录本，导致mRNA降解和eIF4G1蛋白表达水平下降，从而促进自噬、减少肿瘤发生。因此，雷帕霉素可能通过调节m6A水平，决定OSCC的自噬潮，从而影响癌细胞的生物学特性。这一发现拓宽了我们对肿瘤发生过程中自噬和RNA甲基化之间的相互作用的理解，对于OSCC治疗策略的制定至关重要。

meRIP-seq、m6A修饰定量、基因半衰期检测等

这篇文章的主要研究思路整理如下图：

在研究伊始，OSCC发生发展是否涉及RNA修饰仍是一个问号，于是研究者首先对这个问题做了一个初步的鉴定：

1.比较OSCC和癌旁组织的整体m6A水平；

2.检测多种m6A修饰相关的蛋白的表达水平，包括METTL3、METTL14、WTAP、FTO和ALKBH5。

研究者通过实验发现在自噬细胞模型中，FTO表达水平的减少最显著，于是以FTO为研究对象，通过沉默FTO以及自噬抑制剂处理，一系列实验验证（详见研究路线图），证明FTO对OSCC细胞的作用。

研究至此，meRIP-seq登场了：通过对雷帕霉素诱导的自噬OSCC细胞进行 meRIP-seq 及生信分析，GO和KEGG的分析结果显示涉及自噬相关的基因（图2d），研究者取了自噬相关基因和m6A调控基因的交集，有30个（图2e）。

30个基因之中，包括了已有研究表明能够抑制自噬的eIF4G1基因。

于是接下来，就可以愉快地开展针对eIF4G1的基因功能研究了！

首先，可以进一步鉴定eIF4G1的m6A水平变化，这里可以采用 m6A-qPCR 技术，对特定的基因进行精确的m6A修饰水平定量。

然后，关于m6A修饰如何调控下游基因，有潜在的不同的机制，包括影响基因可变剪切、影响RNA稳定性、影响基因翻译效率等。

本研究猜测m6A可能在自噬的过程中诱发了eIF4G1的降解。YFHDF2就是和衰减相关的m6A reader，研究者沉默了YTHDF2，检测eIF4G1的半衰期，发现降解效率减缓了，即 RNA的稳定性 发生了变化。

后续研究者还进行了很完整的体内外实验来研究FTO、YTHDF2是如何调控eIF4G1，影响OSCC细胞发展的（具体可看研究思路图）。

这篇文章的研究思路很经典，包括刚接触m6A修饰课题的时候从何入手进行初筛，如何寻找m6A修饰相关蛋白，怎样挖掘m6A修饰调控的靶基因，可以从哪些方面进一步揭示m6A修饰背后的调控机制。

表观生物具有完备的RNA甲基化修饰研究技术服务，比如meRIP-seq、SELECT-m6A修饰定量技术服务与试剂盒（预售中）、ONT Direct RNA全长转录组测序、SLAM-seq以及Ribo-seq等产品，欢迎拨打电话400-775-0875咨询！

[1] Wang F, Liao Y, Zhang M, et al. N6-methyladenosine demethyltransferase FTO-mediated autophagy in malignant development of oral squamous cell carcinoma. Oncogene 2021 Jun;40(22).

[2] Nombela P, Miguel-López B, Blanco S. The role of mA, mC and Ψ RNA modifications in cancer: Novel therapeutic opportunities. ：Mol Cancer 2021 01 18;20(1).

m6A的前世今生

近年来，m6A RNA修饰的研究已成为当今生命科学领域最前沿最热门的研究方向之一，不断有CNS的文章问世，国自然资助的项目数量也逐年上升。

m6A是什么，m6A调控因子、m6A检测方法有哪些，m6A在人类疾病中扮演哪些作用。本文将做一简明阐述。

N6-methyladenosine也叫m6A，是一种广泛存在于mRNA上的碱基修饰行为，mRNA的内部修饰则用于维持mRNA的稳定性。

mRNA最常见的内部修饰包括了N6-腺苷酸甲基化（m6A）、N1-腺苷酸甲基化（m1A）、胞嘧啶羟基化（m5C）等。N6-甲基腺嘌呤(m6A)在 mRNA 内部修饰碱基中所占比例最大，主要分布在 G(m6A)C (70%)或者A(m6A)C (30%)保守序列中。

早在20世纪70年代，Desrosiers. R等在人哺乳动物细胞的 mRNA 中发现了m6A的存在，但m6A的功能以及作用机制却一直鲜有研究。

直到 2011 年，芝加哥大学何川教授团队在 *Nat Chem Biol *发表文章“N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO”，揭示m6A的可逆化修饰，使 m6A 的研究重新热门起来。

<figcaption style="margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);">图1 RNA常见的碱基修饰行为</figcaption>

从图2中我们可以看到，这是一个已经发生甲基化的核糖核苷酸，确切地说叫N6-methyladenosine。

一共分为2个大的结构，左下角的是五碳糖，图2中a框部分也就是五碳糖的第二位C处的羟基发生脱氧就会变成脱氧核糖核苷酸（从RNA变成DNA）。图2中c框部分标注的，也就是第四位的C处通常会带有磷酸基。图2中b框部分通常就是我们所说的含氮碱基。

这里特指腺苷酸（A），当腺苷酸的第六位N处发生甲基化时，就是我们所说的m6A。

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<figcaption style="margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);">图2 N6-甲基化腺苷酸结构示意图</figcaption>

m6A这种甲基化修饰是可逆化的，调控因子包括甲基化转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白等。

甲基化转移酶包括METTL3/14、WTAP和KIAA1429等，主要作用是催化mRNA上腺苷酸发生m6A修饰。

而去甲基化酶包括FTO和ALKHB5等，作用是对已发生m6A修饰的碱基进行去甲基化修饰。阅读蛋白主要功能是识别发生m6A修饰的碱基，从而激活下游的调控通路如RNA降解、miRNA加工等。

<figcaption style="margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);">图3 参与m6A的酶类</figcaption>

<figcaption style="margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);">图4 m6A调控</figcaption>

甲基化转移酶（methyltransferase）也称为Writers，能够让mRNA上的碱基发生m6A甲基化修饰。METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1492都属于m6A甲基化转移酶的核心蛋白。这些蛋白会形成复合物（complex），共同行使催化功能。

<figcaption style="margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);">图5 METTL3、METTL14及其复合物结构</figcaption>

m6A去甲基化酶主要包括FTO和ALKBH5等。FTO蛋白全称Fat mass and obesity-associated protein，属于Alkb蛋白家族中的一员并且与肥胖相关。

2011年，芝加哥大学何川教授团队首次证实， FTO蛋白是一种重要的去甲基化酶。ALKBH5是另一种重要的去甲基化酶，对细胞核中的mRNA进行去甲基化修饰。在细胞系中敲低ALKBH5后，mRNA上m6A修饰水平显著上升。

发生m6A修饰的mRNA想要行使特定的生物学功能，需要甲基化阅读蛋白，也称为reader。阅读蛋白主要包括YTH结构域的蛋白、核不均一核糖蛋白（hnRNP）以及真核起始因子（eIF）等。这些阅读蛋白的功能主要包括特异性结合m6A甲基化区域，削弱与RNA结合蛋白同源结合以及改变RNA二级结构从而改变蛋白与RNA的互作。

目前检测m6A所用的技术手段包括高通量测序、比色法以及液相色谱质谱联用（LC-MS），常用的方法主要包括MeRIP-seq、miCLIP-seq、LC-MS/MS以及比色法。 其中LC-MS/MS和比色法能够检测mRNA整体的m6A水平，而MeRIP-seq和miCLIP-seq属于高通量测序手段。

LC-MS/MS在液相质谱的基础上采用串联质谱，获得分子离子峰和碎片离子峰，对碱基同时进行定性和定量分析。

LC-MS/MS法第一步 使用TRIzol提取完总 RNA后，可以用oligodT磁珠或者rRNA去除试剂盒获得包括mRNA、lncRNA等在内的RNA。

第二步 使用核酸酶P1（Nuclease P1）将RNA消化成单个碱基。

第三步 加入碱性磷酸酶和碳酸氢铵后孵育数小时，将样本注射入液相色谱仪，计算各个碱基的含量。

第四步 进入质谱串联分析，单个核糖核苷酸会被打断成五碳糖和嘧啶或嘌呤。 最后 根据m6A和总腺嘌呤的比例就能算出m6A在mRNA上整体的甲基化程度。

LC-MS/MS为最早检测m6A的方法，操作较为繁琐。相对于LC-MS/MS较为繁琐的操作，比色法更为简便。研究人员既可以提取total RNA，也可以利用oligodT磁珠富集mRNA。

<figcaption style="margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);">图6 m6A检测方法 （A）LC-MS/MS法；（B）比色法。</figcaption>

2012年之前，全基因组或全转录组水平上鉴定m6A修饰的研究领域是一片空白。

2012年Meyer K. D发表于 Cell 上的论文“Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons”和Dominissini D发表于 Nature 上的论文“Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq”第一次从转录水平上，大范围、高通量地鉴定了人和小鼠m6A的甲基化水平。

这种方法被称为MeRIP-seq或m6A-seq。

MeRIP-seq操作 第一步先对mRNA进行片段化，接下来使用带有m6A抗体的免疫磁珠对发生m6A甲基化的mRNA片段进行富集，然后将富集到的mRNA片段纯化后构建高通量测序文库进行上机测序。另外需要单独构建一个普通的转录组文库作为对照。最后将2个测序文库放在一起进行生物信息学分析，得到m6A甲基化程度较高的区域（m6A peak）。

这种方法优点是方便快捷成本低廉，可以对发生高甲基化的mRNA区域进行一个定性分析。但是MeRIP-seq只能鉴定m6A高甲基化的区域，并不能做到单碱基的分辨率。

2015年，Bastian Linder等发表在 Nature Methods 的文章“Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome”，第一次从单碱基的水平测定m6A。

这种技术被称为miCLIP-seq。

miCLIP-seq操作第一步对富集完的mRNA进行片段化。

第二步，使用带有m6A抗体免疫磁珠与带有m6A的mRNA片段进行结合。

第三步，使用紫外交联进行免疫共沉淀后，在mRNA片段的3’端连上接头序列，在5’端加上P32放射性标记后进行移膜。

第四步，根据放射性标记进行切膜回收后，对mRNA片段进行反转录和纯化回收。

第五步，对反转录组的cDNA进行环化。

第六步，对环化的cDNA进行复线性化，然后构建测序文库上机测序。

<figcaption style="margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);">图7 高通量测序检测m6A （A）MeRIP-seq；（B）miCLIP-seq</figcaption>

1. 肿瘤

2020年3月发表于 Cancer Cell 上的综述性文章“m6A Modification in Coding and Non-coding RNAs: Roles and Therapeutic Implications in Cancer”，文章指出，m6A相关修饰酶在肿瘤中的变化不尽相同，环境改变和位点突变均可导致m6A状态的改变，同时m6A参与一些肿瘤靶向治疗基因的调控。

<figcaption style="margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);">图8 m6A相关修饰酶在肿瘤中的变化</figcaption>

2. 病毒感染

2020年2月发表于 Nature Microbiology 上的文章“N6-methyladenosine modification enables viral RNA to escape recognition by RNA sensor RIG-I”，文章指出，人类偏肺病毒（HMPV）在其RNA中获得m6A，可以模仿正常细胞的RNA，躲避免疫系统的检测。

<figcaption style="margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);">图9 病毒中m6A的作用</figcaption>

3. 神经脱髓鞘改变

2020年1月发表于 Neuron 上的文章“m6A mRNA Methylation Is Essential for Oligodendrocyte Maturation and CNS Myelination”，文章指出，m6A去甲基化酶METTL14的减少会导致少突胶质细胞的减少及中枢神经的脱髓鞘改变，提示m6A在神经细胞的发育中起着重要的调节作用。

<figcaption style="margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);">图10 m6A对神经系统发育的调控。</figcaption>

m6A的研究热点不断升级，今后会有更多的高分文章出现，关联的疾病也会越来越多。

但是，m6A的检测方法较为繁琐，所需费用也比较高，限制的m6A的研究进展以及临床应用，发展快速简便经济的检测方法是今后m6A检测技术的发展方向。

同时在研究层面，m6A作为十分重要的 RNA 表观遗传学修饰，如何与 DNA、组蛋白表观遗传学协同作用调控基因表达，也需要进一步深入探索。

参考文献

m6a甲基化名词解释

m6a甲基化名词解释：mRNA中，5'帽结构的甲基化很常见，腺苷的N6位置上(m6A)的甲基化也较为常见，tRNA是修饰最多的RNA，嘌呤上的甲基化很常见。

DNA甲基化是与基因表达的沉默相关的一种表观遗传修饰。Daniel Tenen及同事提出，活性转录直接调控DNA甲基化的水平。来自被研究很透彻的甲基化敏感基因CEBPA的一个非编码RNA与DNA甲基转移酶DNMT1相互作用，阻止在CEBPA位点上的甲基化，从而帮助CEBPA表达。

类型

甲基化包括DNA甲基化和蛋白质甲基化，DNA甲基化：脊椎动物的DNA甲基化一般发生在CpG位点（胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点，即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点）。经DNA甲基转移酶催化胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。人类基因中约80%-90%的CpG位点已被甲基化，但是在某些特定区域，如富含胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG岛则未被甲基化。

一篇m6A综述阅读笔记

title: 文献笔记-Where, When, and How Context-Dependent Functions of RNA Methylation Writers, Readers, and Erasersinfection

date: 2019-11-22 12:00:00

type: "tags"

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注：以前看综述的时候，我喜欢把原文逐字翻译为汉语，效率比较低，现在我就采用笔记的形式的来看综述，按照原文的结构，把关键点记录下来，再加上自己的理解即可。

Hailing Shi, Jiangbo Wei, Chuan He,Where, When, and How: Context-Dependent Functions of RNA Methylation Writers, Readers, and Erasers,Molecular Cell,Volume 74, Issue 4,2019,Pages 640-650,

ISSN 1097-2765, .

细胞RNA会天然地经历各种化学修饰。这些经化学修饰的核苷酸又赋予了其自身结构的多样性，从而在各种有序的代谢与机体的功能方面发挥着各种调控功能，进而影响了基因的表达。随着对回贴(mapping)位点修饰的全转录组测序方法的发展，对精确修饰进行检测和定量的高灵敏质谱方法的进步，以及参与修饰的“ 效应器 ”(effectors，包括各种能改变各种修饰位点的酶，例如 写入器 ( writers )和 擦除器 ( erasers )和能识别化学修饰位点的 读取器 ( readers )）理解的加深，最近几年有关RNA修饰的研究呈现暴发式地增长。然而由于RNA种类庞杂，表达水平有差异，因此这给RNA修饰的研究带来了很大的挑战，另外，RNA的修饰还与细胞类型，组织特异性，以及修饰 效应器 的定位有关，这又增加了研究难度。我们在这篇综述里，重点阐述了最近几年关于 -甲基化转换酶(m6A, )功能的研究进展，强调了环境(context)对RNA修饰调控和功能的重要性。

早期研究发现，m6A主要发生在(G/A)(m6A)C序列上。最近的研究发现，m6A主偏向于出现在终止密码子和3'UTR上，因此我们可以推断，m6A可以影响基因的表达。

m6A途径的效应器(effectors)包括 写入器 (writers)， 擦除器 (erasers)和 读取器 (readers)，其中 写入器 往核苷酸上添加上甲基， 擦除器 反之，即去掉核苷酸上的甲基， 读取器 则是能够识别那些核苷酸上含有甲基的序列，它们的成员如下图的Figure 1所示：

m6A是通过一个复合物加到mRNA上的（Figure1），这个复合物有多个亚基，包括METTL3，METTL14，WTAP，VIRMA，ZC3H13，HAKAI，RBM15/15B。其中包括以下成员：

METTL3在各类细胞中的分布不同，例如在HeLa细胞中，METTL3/METTL14会形成二聚体结构与WTAP产生相互作用，然后进入细胞核形成斑点(speckle)。METTL3和WTAP中含有NLS(nuclear localization signals)，NLS的突变会导致复合物无法入核。METTL3还存在于一些细胞质中，例如在一些癌细胞系，包括HeLa，MDA-MB-231，MOLM13细胞系等。还有一些情况，例如在小鼠皮质神经元中，METTL14位于细胞质和细胞核。现在还不清楚为什么METTL3的定位为什么会出现如此差异。METTL3/METTL14的比例在不同的细胞系中也有差异，这可能会影响METTL3的定位。

写入器的招募导致了转录本上的m6A的特异性，这一招募过程可能是由TF或表观遗传标记介导的，如下下图的Figure 2所示：

当出现热休克时，METTL3就会定位到染色质的热休克相关的基因上，m6A就会被添加到热休克转录本上，从而诱导这些转录本在应激压力下被清除。UV诱导DNA破坏时，METTL3/14就会在2分钟内定位到UV诱导的损伤位点，同时伴随着m6A活动的增强。在人类多能干细胞的TGF- 信号转录通路转导方面，活化的SMAD2/3会与METTL3/14-WTAP相互作用，诱导m6A添加到特定的转录本上。在AML细胞中，一部分METTL3会通过METTL14非依赖方式与CCAAT增强子结合蛋白zeta(CEBPZ)的启动子区域结合。在HepG2细胞中，H3K36me3能通过与METTL14相互作用招募 写入器 ，诱导mRNA的CDS和3'UTR上添加m6A。

METTL3还能作为一个潜在的m6A读取器，在Figure 2B中，我们可以看到，在肺癌细胞中，METTL3此时并没有发挥催化作用，而是在细胞质中锚定到了3'UTR上，促进了一个报告mRNA的翻译。进一步的研究表明，METTL3是通过eIF3h相互作用来促进翻译的。

METTL3蛋白自身会通过PTM或与其它蛋白质相互作用来发挥调控功能，例如人类的METTL14能够诱导METTL3的丝氨酸399磷酸化。人类的METTL3会出现SUMOylation修饰，导致METTL3/14的活性降低。但这些现象的机制还不清楚。

METTL3/14复合物偏爱RRACH模序(R=A或G；H=A，C或U)，METTL16则偏爱另外的序列与结构。METTL16被验证的两个特异性序列是U6(U6 small nuclear RNA, snRNA)和人类MAT2A(methionine adeno-syltransferase 2A)上的一个发夹结构(hp1)，MAT2A编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adeno-sylmethionine synthetase, SAM synthetase)。有实验分析发现，METTL16偏爱一个形成茎环结构膨大处的UAC(m6A)GAGAA序列。EMTTL16介导的MAT2A甲基化是SAM稳态的负反馈信号。最近发现了ZCCH4是一个新的m6A读取器。

m6A读取器通过作用于含有m6A的mRNA来发挥作用，Figure 1中可以把读取器分为三类。

第一类读取器含有YTH结构域（YTH的全是YT521-B homology），这些成员包括YTHDF1-3(YTH domain family 1-3)，YTHDC1-2(YTH domain containing 1-2)（参考Figure 1）。细胞质中的YTHDF2会通过招募CCR4-NOT腺嘌呤酶复合物来诱导靶转录本的部分降解。细胞质中的YTHDF1和YTHDF3能促进HeLa细胞中靶转录本的翻译。细胞核中的YTHDC1有多个作用，包括招募某些剪接因子调控mRNA的剪接，促进mRNA的输出，加速某些转录本的降解。YTHDC2调控mRNA的稳定，翻译以及精子形成。

第二类读取器是HNRNPs，全称是heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，成员包括HNRNPC，HNRNPG与HNRNPA2B1，它们能调控靶转录本的剪接，加工，它们能与RNA的某些结构结合，这些结构是由m6A介导形成的，因为m6A会重构局部的RNA结构，调控RNA-蛋白质之间的相互作用，这一现象称为m6A开关(m6A-switch)。

第三类读取器含有相同的RNA结合结构域(RBD, RNA binding domains)，例如KH结构域(K homology)，RNA识别模序(RNA recognition motif)，以及RGG( arginine/glycine-rich)结构域，它们都能与含有m6A的mRNA结合，包括FMR1和IGF2BP1-3。FMR1(Fragile X mental retardation 1)含有3个KH结构域，1个RGG结构域，它有可能通过与YTHDF1和YTHDF2相互作用来影响RNA的转移，RNA的稳定。IGF2BP1-3(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins 1–3)能通过m6A的方式稳定靶转录本（YTHDF2与之相反，它是降解靶转录本）。IGF2BP蛋白功能的核心是KH3-4结构域，这是与m6A结合的关键区域。

Prrc2a是最近发现的一个读取器，它与髓鞘形成有关，具体机制不明。

以下为作者的几个猜测。

第一，读取器有可能与其它的RBP相互作用，从而被招募到mRNA的不同区域。IGF2BP1-3和YTHDF2通过在不同位点来调控mRNA的稳定性，例如IGF2BP1-3结合到3'UTR，而YTHDF2结合到CDS区。而RBP对RNA的识别取决于多个因素，例如结合位点的序列，序列的侧翼以及RNA的二级结构。因此RBP与读取器蛋白质的相互作用有可能涉及了m6A位点的特异性。

第二，m6A位点的密度和序列也可能与之有关。

第三，读取器蛋白会在细胞区室的特定位点富集，因此会偏向与局部一些RNA类型结合。例如，YTHDF1-3，FMR1和HNRNPA2B1位于细胞的应激颗粒核心地区。在乳腺癌细胞中，YTHDF1-3，HNRNPK和IGF2BP2-3位于细胞的突起(protrusion)。

甲基化可以促进翻译或影响某一转录本的稳定性，这取决于揎细胞环境下哪个读取器占据主导地位，如Figure 3所示：

在某些刺激下，例如热休克应激或病毒感染会诱导细胞质中的YTHDF进入细胞核。在热休克出现的几小时内，YTHDF2的转录本与蛋白水平都上升，并且多数YTHDF2转移到细胞核内。有人认为，YTHDF2核心的YTHDF2会与去甲基化酶FTO竞争，阻止那些热休克应答基因5‘UTR的去甲基化，从而增强这些基因在细胞质中非加帽方式的翻译(cap-independent translation)。体外实验发现，YTHDF2能抑制FTO的去甲基化活性。在Vero细胞感染实验中，细胞感染了enterovirus type 71后，YTHDF1和YTHDF2会上调，并且在感染12小时后分布在细胞质，感染24小时后分布在细胞核，这一现象机制不明。

在有丝分裂后期的细胞中，当需要功能蛋白时，YTHDF1的翻译促进作用就变得特别明显(Figure 3)。在损伤诱导的轴突再生的背根节(DRG)模型中，再生相关基因大量地被甲基化，在这个恢复过程中，YTHDF1是蛋白质强烈合成所必需的条件；相比之下，YTHDF1在损伤前的基础翻译增强方面，作用很小。这一现象与最初在HeLa细胞中研究YTHDF1时类似，YTHDF1会促进一些转录本的翻译。在关于记忆研究方面，有研究发现，YTHDF1的缺陷会导致海马依赖性神经元功能出现障碍，恢复YTHDF1的蛋白水平，则能修复这种问题。YTHDF1依赖的翻译增强会在一些癌细胞中持续出现，而在其它一些细胞中则是由刺激诱导的，这一过程是如何触发的，还不清楚。

YTHDF1-3的结构类似，它们都含有N末端低复杂序列，和C末端的保守YTH结构域。但是它们的功能并不相同，在不同的细胞中，它们有的能促进蛋白翻译，有的能抑制蛋白翻译，具体的案例可以参考原文。并且在不同的m6A阅读器蛋白之间还存在着交叉作用或竞争作用，即使在FTO和阅读器之间，也有着类似的作用。因为这些蛋白本身就构成了一个有相互作用的网络结构，因此要理解它们的环境调控作用对于相关的研究有着重要意义。

m6A甲基化可以被FTO或ALKBH5逆转，这两个蛋白也就是m6A擦除器。FTO是第一个被发现的m6A擦除器。FTO能够去甲基化m6Am，以及部分mRNA上的cap-m6Am，如Figure 4所示：

CLIP-seq验证了很多FTO的结合位点，这些结合位点包括tRNAs，snRNA等。FTO的空间分布也能发挥调控作用，FTO的N末端有一个NLS，它能部分地分布在细胞核中，也能分布在细胞质中，FTO的分布在不同的细胞系中有所不同，例如在AML细胞中的分布和HEK，HeLa细胞中的分布就不同，这可能与肿瘤的发生有关，FTO在AML细胞中的这种分布也有可能是环境依赖的，因为2HG(2-hydroxy-glutarate)能抑制FTO。

CLIP-seq的测序数据分析表明，在某些细胞系中，FTO偏爱结合GAC-和/或GGAC模序。有研究发现，FTO的表达和定位可能被PTM调控（例如Lys-216）。

位于mRNA的5'cap中的+1核糖上，它几乎是与内部m6A(internal m6A， 这个内部指的是mRNA中间的部分 )同时发现的。m6A可能占据了整个腺苷酸的0.1%-0.4%，它主要发生在第二个核苷酸2’-O-methylated( )的帽子结构附近。只有不到30%的 含有m6Am。m6Am的比例占到整个mRNA的m6A十分之一或更低（在一些细胞系中还要低）。m6A丰度要远高于 ，因此，虽然FTO更偏爱结合 ，但是FTO的主要靶点还是m6A。由于几乎所有的mRNA帽子结构都在胃镜核中被加帽蛋白结合，因此在细胞核中，cap- 不太可能被去甲基化，这也反映了FTO对 的局限，如Figure 4所示。现在研究发现的FTO还功能涉及：热休克应答，UV损伤应答，HCV感染等方面。

最初研究认为FTO介导的 的去甲基化在功能上类似于DCP-2介导的去帽(decapping)化诱导mRNA的降解以及miRNA介导的mRNA降解。当敲低FTO后，FTO的靶mRNA出现了很多变化，这些效应被认为是由于 的去甲基化导致的，但是FTO敲低与那些只含有m6A或 转录本水平之间的相关却不支持这个结论，并且发现只有内部m6A修饰的转录本的变化与FTO的敲低相关。

后来发现了PCIF1是mRNA的 甲基转移酶，它只加工 ，却不加工内部的m6A(internal m6A)。还有研究发现，PCIF1添加的 并不改变基因表达的水平或转录本的稳定性，这也不支持刚开始的观点，即FTO介导的 的去甲基化导致的mRNA降解。另外，有研究发现，当FTO敲低时， 被认为还能促进那些含有 mRNA的翻译效率，但也有一些研究发现了相反的现象，这一过程的调控也有可能是与环境有关。

ALKBH5是第二个被发现的m6A去甲基化酶。ALKBH5在小鼠的精子形成中发挥了作用，ALKBH5和FTO的表达在不同组织中各异。例如，在小鼠中，Alkhb5主要表达在睾丸，而Fto主要表达在大脑，这可能与它们参与的不同生物学途径有关。在人源细胞系中敲低ALKBH5后，会诱导其靶RNA从细胞核转移到细胞质。几乎所有报道的ALKBH5功能研究都揭示了类似的分子途径，ALKBH5介导某些转录本的3'UTR m6A，其中就包括促进缺氧诱导的HIF依赖的乳腺癌干细胞表型，通过ALKBH5-FOXM1途径调节的胶质母细胞瘤增殖和肿瘤发生，调控雄性生殖细胞中长3'UTR mRNAs的剪接和稳定。

作者在结论部分中讨论了两个问题，第一个是m6A的调控，第二个是m6A未解决的一些问题。

其中m6A的调控功能可能受几个层面的影响，包括以下几个方面

第一，m6A的功能取决于细胞分化和细胞的发育状态。

第二，m6A的功能可能被环境因素或细胞信号触发。

第三，m6A效应子的定位也影响了m6A的功能。

第四，即使是同一个转录本，m6A精确的定位和其它的修饰也会影响其功能。

关于m6A的一些关键问题还没搞清楚，包括以下几个方面：

第一，m6A效应子针对转录本的选择性和m6A位点的选择性是如何实现的？

第二，m6A效应子（包括写入器，擦除器，读取器）是如何整合到不同的生物信号转导与调控过程的？

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