山西甲烷转染试剂厂家排名。山西转染试剂价格

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• 1、质粒与siRNA转染试剂的选择
• 2、转染的分类
• 3、sw480细胞转染求助
• 4、什么样的转染试剂转染效果比较好呢
• 5、转染实验可以加血清？血清都有哪些参数？
• 6、sirnanc怎么设计-如何设计有效的siRNA

质粒与siRNA转染试剂的选择

优质回答质粒转染试剂是质粒转染能否成功的关键。目前，最为知名和权威的质粒转染试剂无疑是国际巨头赛默飞的Lipofectamine3000，但此君好用，身价不菲。一支1.5ml的Lipofectamine3000，官网售价高达8010元，实在让人不易亲近。百代生物荟萃了一群海归博士，大家顶着博士的学衔，总想着要干点什么。于是，锚定Lipofectamine3000的性能，经过几年努力，交出了一份还算满意的答卷，研发出了RFect系列质粒转染试剂。考虑到科研同仁的不同需求，我们的转染试剂中有专门高效转染质粒的试剂，也有既能高效转染质粒DNA也能高效转染siRNA的试剂；既有高效转染贴壁细胞的质粒转染试剂，也有高效转染原代细胞和悬浮细胞的转染试剂，现向诸君具体介绍如下：

一、质粒DNA转染试剂:   RFect 系列 质粒DNA转染试剂

RFect系列质粒DNA转染试剂专门用于质粒DNA的转染，具有非常卓越的转染性能，可高效转染绝大多数贴壁细胞、原代细胞和悬浮细胞。其中，RFect质粒DNA转染试剂主要用于贴壁细胞的质粒转染，转染效率在贴壁细胞中可高达90%，完全媲美Lipofectamine3000的质粒转染效率。RFect悬浮细胞质粒DNA转染试剂主要应用于悬浮细胞的质粒DNA转染，在293F中，转染阳性率可高达85%，在CHO-S中，转染效率可达50%，显著优于绝大多数同类试剂。特别地，RFect悬浮细胞质粒DNA转染试剂的细胞毒性很低，转染后24小时细胞死亡率不到10%。因而，随着培养表达时间的延长，目标蛋白的表达量将会显著增长，远远优于那些毒性较大的转染试剂。对于原代细胞，考虑到其细胞膜比较敏感，内吞作用不够明显等因素，我们采用了更加温和、低毒的组方----RFect原代细胞质粒DNA转染试剂。在原代肝癌细胞中，其质粒DNA转染效率可达80%，而细胞未见明显死亡。RFect系列质粒转染试剂的使用都非常方便，不需要使用特殊的低血清培养基，不需要额外增加培养基成本，也不需要苦苦等待培养4-6小时后换液，只需使用普通的血清培养基就可以了。

表1  RFect系列质粒转染试剂

二、质粒DNA和siRNA均可高效转染:   RFect Prime核酸 转染试剂

RFect Prime系列核酸转染试剂盒是在RFect质粒DNA转染试剂盒的基础上进一步研发成功的可用于各类核酸高效转染的试剂盒。RFect Prime功能强大，不仅可高效转染较大分子的质粒DNA，还可高效转染mRNA、siRNA、mimics、反义核酸和各种小分子DNA，转染效率在贴壁细胞中可高达90%。目前，国际上具有如此强大核酸转染功能的转染试剂主要为Lipofectamine3000，这也是其售价如此之高的根本原因。我们经过长期研究，反复实验，研发出的RFect Prime系列核酸转染试剂的性能可完全媲美与Lipofectamine3000。特别地，我们有专门的原代细胞核酸转染试剂和悬浮细胞核酸转染试剂，对原代细胞和悬浮细胞的核酸转染性能显著优于国际同类产品。RFect Prime的转染性能非常专业化，针对部分客户需要将2种核酸如质粒DNA和siRNA同时转染入同一细胞，我们研发了RFect CO Prime核酸共转染试剂，可完美地将质粒DNA或mRNA与siRNA或反义核酸或小分子DNA转染入同一细胞。在大多数贴壁细胞中，RFect CO Prime的质粒转染阳性率可高达90%，而在质粒转染阳性的细胞中，95%的细胞均可共转染siRNA或反义RNA。RFect Prime系列核酸转染试剂盒的价格具有非常的亲和力，拥有如此强大的转染性能，价格还不到Lipofectamine3000的50%，是绝大多数核酸转染专家的理想选择。

表2 RFect  Prime系列核酸转染试剂

三、普通质粒DNA转染试剂:  Lipofect5000 质粒DNA转染试剂

Lipofect5000是一款通用型入门质粒转染试剂，适用于对质粒转染要求不高的研究者，或者研究经费比较紧张的研究者。Lipofect5000可转染绝大多数贴壁细胞和部分悬浮细胞。在贴壁细胞中，Lipofect5000质粒DNA的转染阳性率在60%-70%之间，对于血管内皮细胞，Lipofect5000具有更加优异的转染性能，转染阳性率可高达85%。对于普通的质粒转染实验，这样的转染效率已经足够。特别需要指出的是，Lipofect5000的价格非常便宜，0.5mL的定价只有490元，在同类性能的转染试剂中，Lipofect5000的价格属最为优惠的之一。如果您刚刚开始质粒转染实验，或对质粒转染要求不是很高，或者经费比较紧张，Lipofect5000显然是您比较理想的选择。

转染的分类

优质回答包括：

1.DEAE-葡聚糖法

DEAE-葡聚糖是最早应用哺乳动物细胞转染试剂之一，DEAE-葡聚糖是阳离子多聚物，它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取，用DEAE-葡聚糖转染成功地应用于瞬时表达的研究，但用于稳定转染却不是十分可靠。

2.磷酸钙法

磷酸钙法是磷酸钙共沉淀转染法，因为试剂易取得，价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定转染的研究，先将DNA和氯化钙混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，最后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞上，通过细胞胞膜的内吞作用摄入DNA。磷酸钙似乎还通过抑制血清中和细胞内的核酸酶活性而保护外源DNA免受降解.

3.人工脂质体法。

人工脂质体法采用阳离子脂质体，具有较高的转染效率，不但可以转染其他化学方法不易转染的细胞系，而且还能转染从寡核苷酸到人工酵母染色体不同长度的DNA，以及RNA,和蛋白质。此外，脂质体体外转染同时适用于瞬时表达和稳定表达，与以往不同的是脂质体还可以介导DNA和RNA转入动物和人的体内用于基因治疗。LipoFiterTM脂质体转染试剂(LipoFiterLiposomalTransfectionReagent)是一种适合于把质粒或其它形式的核酸,以及核酸蛋白复合物转染到培养的真核细胞中的高效阳离子脂质体转染试剂。它可以和带负电荷的核酸结合后形成复合物，当复合物接近细胞膜时被内吞成为内体进入细胞质，随后DNA复合物被释放进入细胞核内，至于DNA是如何穿过核膜的，其机理目前还不十分清楚。 外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法、脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。

利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。 （1）材料

293T细胞、MyoD表达质粒和EGFP表达质粒、DMEM培养基、链霉素/青霉素（双抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸盐缓冲溶液）、胰酶/EDTA消化液、转染试剂（TransFast）

（2）器材

20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip头酒精灯、废液缸、血球计数板、涡旋振荡器、恒温水浴箱、台式离心机、35mm培养皿、转染管、15ml离心管、观察用倒置显微镜荧光显微镜和CCD 细胞传代

(1)试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。

(2)弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。

(3)用Tip头加入1mlTrypsin液，消化1分钟（37。C，5%CO2)。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。

(4)加入1ml的含血清培养基终止反应。

(5)用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。

(6)将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。

(7)用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。

(8)将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。

(9)将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。

细胞转染

1）转染试剂的准备

A.将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。

B.震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。

2）选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。

5）将混合液在室温放置10—15分钟。

6)吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。

7）加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。

8）到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。

第二次细胞传代

1） 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。

2） 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新放入培养皿中。

3） 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

sw480细胞转染求助

优质回答西南大学,高效率转染SW480人结直肠癌细胞，2020-4-28发表文章已见刊，转染经验分享

发表文章转染条件

A、HCT-116, SW480, HT-29人结直肠癌细胞

B、AURKA质粒DNA

C、转染细胞融合度50%

D、96孔板每孔使用0.5μg质粒DNA

6孔每孔使用10 ug质粒DNA

E、Advanced DNA RNA转染试剂

(注意：本实验中用到的细胞密度、转染质粒DNA用量不适用于LIPO3000/2000)

发表文章部分内容

Overexpression of AURKA Plasmid for AURKA overexpression was obtained from VectorBuilder. Details about plasmid containing the AURKA gene can be found at ;html. colon cancer cells (HCT-116, SW480, HT-29) were seeded at 50% confluency for 24 h in six-well and 96-well plates. Plasmid (10 ug per-well for six-well and 0.5 μg per-well for 96 plates) and the Advanced DNA RNA transfection（zeta life,USA) reagent were mixed in equal proportionsand added to the cell culture medium for 6 h. DOX (1 μg/ml) was added to induce the expression of AURKA. After addition of DOX and PAL for 36 h, cell viability was measured by MTT and apoptosis was detected by。

什么样的转染试剂转染效果比较好呢

优质回答美国SignaGen公司的GenJet （Ver.II），LipoD293及PolyJet针对哺乳动物细胞的DNA体外转染试剂，均为您提供两种不同的转染步骤——一般步骤及高级步骤，这两种步骤分别针对不同的哺乳动物细胞。高级步骤主要针对难转的哺乳动物细胞，例如：MDCK，MDA-MB231，Caco-2等细胞。使用一般的转染步骤若是转染效率低于5%，那么使用高级转染步骤则可以将转染效率提升至60%。

如何选择转染步骤则取决于您的细胞特性。对于诸如HEK293，Hela，CHO，3T3，COS，HepG2，LNCaP，PC3，PC12，U2-OS，L929，MCF-7及Huh-7等常用细胞，一般的实验步骤就能得到满意的转染结果。对于诸如MDCK，MDA-MB231，Caco-2，SaoS-2及HUVEC等难转细胞，可以选用高级转染步骤。针对您的细胞，若是您尚不明确选择哪种转染步骤，我们建议您可先尝试一般步骤，如果您使用一般步骤得到的转染效率低于5%，那么您的细胞比较难转，您可尝试高级转染步骤。

需要的话可以联系我：jnqsw@163.com

转染实验可以加血清？血清都有哪些参数？

优质回答血清主要参数

血清可以提供细胞生长所必需的生长因子和营养元素，某些细胞特别是转化后的细胞，对于血清的需要量是很低的，在0.5 ％左右。有些细胞被“培养成“只生存在低血清浓度的培养基中。由于细胞生长所需的物质已经被完全定性，所以更多的细胞是被培养在添加有特定物质的基础培养基中。如果细胞能够生存在不添加血清的培养基中则是一种比较幸运的情况。

使用血清的时候有一些参数要注意：

血清的浓度 大多数细胞的适宜浓度为5% ～ 20% 。

血清的种类 有些细胞偏爱马的血清，组织细胞养的标准血清为小牛血清，而有些细胞则需要更贵的胎牛血清，还有些细胞（特别是人的）则需要最贵的同种生物血清。

血清是否为热灭活血清   血清的某些成分遇热失活，比如补体。

能从哪里得到血清    由于特定的细胞只能使用特定的血清，使用之前要先向实验室的人员或正在培养细胞的人员询问。虽然不同的公司价格不同，但是血清的选择标准不应该是省钱。

热灭活血清

把冻存的血清在室温条件下融化，如果是500 ml 体积可能要5~6h。融化后的血清在65℃保温30 min 后分装。分装时要根据血清的浓度和培养基所需要的量，分装后要冻存，使用时再把冻存的溶液放入37℃水浴中融解。

  普通转染实验为什么不能加血清

血清中含有大量的蛋白质，在转染过程中，带负电的蛋白质可能干扰阳离子脂质体对核酸的吸附，影响转染效率。另外，使用脂质体等转染试剂时，由于含血清转染会将血清中的蛋白带入细胞，引发细胞毒性，导致转染效率降低，故不能有血清转染。这些转染试剂要求在转染前换无血清培养基，转染后4-6h在更换成有血清培养基，这其实是为了减轻转染造成的细胞毒性。这样不同的细胞及转染试剂要求转染的条件是不同的。最好是在第一次实验前做一个预实验，比如：HeLa，293，CHO，COS7， MCF－7，HepG2等细胞，是否加血清，对不同的细胞是有不同的影响的，有些细胞是可以有血清的，有些加血清就会受影响。所以，普通的转染试剂一定要进行预实验，和条件优化。

转染后在6小时左右最好换液且换为有血清的培养基，其一因为普通转染试剂对细胞的毒性作用大，其二可降低因血清的缺乏引起的细胞的死亡。转染时不加血清是防止血清的干扰作用，转染后可适时加入。加入过早会引起未转染细胞的优势生长，过晚会引起较多细胞死亡。可实时观察1/5细胞变圆的时候加入血清。

相对来说，EntransterTM只浓缩包裹核酸不会将血清带入细胞，其内毒素和细胞毒性都非常之低，加上转染复合物能够高效的在完全培养基中形成，因而整个转染过程可以在含血清而且是含有抗生素的培养基中操作，不用在有血清和无血清之间更换，增加工作量，同时有血清转染不仅不造成细胞毒性，而且由于血清的存在，有利于细胞的状态维护，提高转染效率。

细胞毒性的大小往往意味着对细胞生理活动影响的大小。这会对相关研究数据产生严重的干扰，甚至影响研究的结论。因此，选择一种毒性较小的转染试剂是细胞转染成功的关键因素之一。

sirnanc怎么设计-如何设计有效的siRNA

优质回答siRNA有哪些设计？

以前人们一般应用较长的dsRNA作为基因沉默的工具,但后来发现长链dsRNA特异性较差。它不仅可激活RnaseL,导致非特异性RNA降解,而且还能激活依赖于dsRNA的蛋白激酶R(protein:kinase:R,PKR),PKR可磷酸化翻译起始因子e:IF2并使其失活,从而抑制翻译起始。后来人们发现小于30bp的dsRNA即可有效引起基因沉默,并且不会产生非特异抑制现象,进一步研究表明抑制作用最强的是长21bp、3′端有两个碱基突出的siRNA。

但RNAi技术要求siRNA反义链与靶基因序列之间严格的碱基配对,单个碱基错配就会大大降低沉默效应,而且siRNA还可以造成与其具同源性的其他基因沉默(也叫交叉沉默),所以在siRNA的设计中序列问题是至关重要的。要求所设计的siRNA只能与靶基因具高度同源性而尽可能少的与其他基因同源。

设计siRNA序列应注意以下几点:①从靶基因转录本(mRNA)起始密码子AUG开始,向下游寻找AA双核苷酸序列,将此双核苷酸序列和其下游相邻19个核苷酸序列作为siRNA序列设计模板,有研究结果显示GC含量在45%55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效;

②每个基因选择45个siRNA序列,然后运用生物信息学方法进行同源性比较,例如使用BLAST(),剔除与其他基因或EST序列有同源性的序列,选出一个特异性最强的siRNA进行合成;

③尽量不要以mRNA的5′端和3′端非翻译区及起始密码子附近序列作为设计siRNA的模板,因为这些区域有许多调节蛋白结合位点(如翻译起始复合物),调节蛋白会与RISC竞争结合靶序列,降低siRNA的基因沉默效应。

如何设计有效的siRNA

1.化学合成

尽管化学合成是最贵的方法,但是却是最方便的——研究人员几乎不需要做什么工作。包括Ambion和Qiagen公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高,定制周期长,特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高,为一个基因合成3—4对siRNAs的成本就更高了,比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。

最适用于:已经找到最有效的siRNA的情况下,需要大量siRNA进行研究

不适用于:筛选siRNA等长时间的研究,主要原因是价格因素

2.体外转录

通过体外转录的方法可以合成siRNAs,这样的成本相对化学合成法而言比较低,是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。更重要的是采用这种方法能够比化学合成法更快的得到siRNAs。以Silencer

siRNAConstructionKit为例,一旦得到DNA

Oligo模版(这个还是需要DNA合成的,不过DNA合成的成本就比较低了),只要24小时就可以,不需要等很久。这个方法的不足之处是实验的规模受到限制,虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs,但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比,还是需要占用研究人员相当的时间——毕竟,化学合成只需要定购就可以了。值得一提的是体外转录得到的siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果(0.5-20nM

vs.50-100nMpertransfection)

最适用于:筛选siRNAs,特别是需要制备多种siRNAs,化学合成的价格成为障碍时。

不适用于:实验需要大量的,一个特定的siRNA。长期研究。

siRNA实验方法和设计常见问题解答

Q:如何选择转染方法和转染试剂

A:我们的siRNA适用于各种转染方法。转染方法和转染试剂的选择,需要根据细胞来选择,对于容易转染的细胞,常用的转染方法是脂质体转染。

Q:对于难转染的细胞,应该如何提高其转染效率转染效率又该如何确定

A:1)对于贴壁细胞,推荐采用转染试剂转染即可;2)对于难转染的细胞的转染,如何提高转染效率的问题也是目前研究的技术难题。一般建议使用电转的方法,但是由于电转的方法对细胞损伤比较大,该方法也未必是最佳的。

转染效率的确定,常用的是使用荧光标记的siRNA,通过荧光显微镜,共聚焦显微镜,流式细胞仪检测的方法。具体可以参考我们的产品说明书。

Q:细胞的转染效率是否与siRNA序列相关

A:转染效率的高低取决于与细胞自身及转染方法,而于siRNA的序列并没有直接关系。因此,siRNA在不同的细胞转染效率可能不一样。

Q:转染siRNA时候的细胞密度多少为宜

A:依不同的转染方法或转染试剂而定。如使用lipofectamine2000作为转染试剂,单独转染siRNA,30%～50%密度较佳;而siRNA与质粒共转染,密度可以到80%-90%。

Q:siRNA转染时的培养基要求,可否含血清

A:不同的转染试剂可能有不同的要求,对于lipofectamine2000,在配制siRNA和lipofectamine2000混合物时不能含有血清,但细胞培养基可以含有血清,但不能含有抗生素。

Q:siRNA的储存液体浓度和工作浓度有何区别

A:siRNA的贮存浓度就是保存的最佳浓度,锐博推荐的贮存液浓度为20μM;而siRNA的工作浓度就是使siRNA能够达到最佳沉默效果的转染浓度,一般10～100nM范围内,锐博生物推荐的转染浓度是50nM。

Q:转染时该如何分组分组的目的是什么

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Q:为什么说阳性对照在RNA干扰实验中很重要

A:阳性对照作为一个实验系统检查是很重要的。也就是说,当您看到siRNA阳性对照的预期实验结果时,您能确保在您的实验方法中您的转染、RNA提取物和检测方法是可靠的。

Q:阳性对照及其阴性对照在RNAi实验中的作用如何选择

A:阳性对照指的是已经验证的针对看家基因或报告基因有效的siRNA,用于监测实验体系和实验方法的可行性。我们可以提供的阳性对照siRNA有针对GAPDH,ACTB,GFP/EGFP有效的siRNA作为阳性对照,客户可以根据具体的实验需要选择。阴性对照往往是非特异的siRNA,主要用于说明siRNA作用的特异性。阴性对照的选择可以是通用的序列(universal)或是随机打乱的序列(scramble),客户可以根据实验要求选择。

Q:用荧光对照siRNA如何检测转染效率是不是每次实验都必须做

A:我们提供的转染对照siRNA带有Cy3或Cy5荧光标记,可以通过荧光显微镜,共聚焦显微镜,流式细胞仪等荧光检测仪器检测。除此之外,还应该通过阳性对照实验进一步确定。转染效率的高低主要与细胞自身相关,同等实验条件下,每次转染细胞转染效率应该是相近的,因此可以不必每次都做。但如果每次实验都做一个荧光对照组,将会更加便于排除一些实验问题。

Q:siRNA荧光染料的最大吸收率和发射率各在哪个波段

A:FAM在495nm处有最大吸收率,在520nm处有最大发射率。

Cy3在550nm处有最大吸收率,在565nm处有最大发射率。

Cy5在643nm处有最大吸收率,在667nm处有最大发射率。

Q:转染后出现细胞死亡是什么原因如何优化转染条件

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Q:到了转染时间发现细胞密度太低,该如时转染还是让细胞多长一天再转染

A:细胞生长需要一定的密度,而转染试剂对细胞有一定的毒性,如果转染时细胞密度过低,细胞可能会因此生长异常甚至死亡。转染前要求良好的细胞状态和细胞活性,一般也不建议用生长几天的细胞做转染。

Q:siRNA的作用效果应该如何检测

A:通常可以从三个方面来相互验证siRNA的作用效果

3)根据目的基因的功能,从细胞表型的水平检测。

Q:siRNA在细胞内可以作用多长时间什么时候才是最好的检测时间

A:siRNA介导的RNAi属于瞬时现象,不能稳定传代,一般其作用时间不可能维持很长时间,通常建议在转染后34天内完成检测。最佳检测时间,因细胞、目的基因而异,多在转染后2448小时之间检测。

Q:为什么要强调mRNA水平检测可以直接检测蛋白和功能吗

A:siRNA直接作用于mRNA,因此mRNA水平检测是最直接在指标。

很多客户认为,mRNA的降解直接的结果应该是对应蛋白质含量的下降,因此蛋白水平的检测结果也应该可以作为有效性的检测指标。事实上,很多情况下往往出现,mRNA下降水平与蛋白下降水平不对应的现象。其可能原因有:

Q:干扰效率多高才是好的靶点

A:没有明确的界定,干扰效率高低因不同的细胞类型和不同的基因而异。不同细胞类型的转染效率也不尽相同,不同基因的表达水平也相差较大,主要看干扰效果而定。

Q:沉默效果不理想,应该如何处理

A:最常见的影响沉默效果的两个原因是:转染效率低和siRNA序列设计的效果不理想。如果您初次使用siRNA或采用了新的细胞系,并发现沉默效果不佳,我们建议您对转染效率进行检测,并选择优化转染条件。如果您已经对实验转染条件进行优化但是问题依然存在,我们建议您换用另一种转染试剂或是采用其他技术,这也许能提高转染效率。如果已经提高了转染效率但是沉默效果仍然未达到要求,可能是因为siRNA序列设计的效果不理想。

Q:siRNA反而使得目的基因表达上调了,这是什么原因该怎么解决

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Q:我从阴性对照实验中得到和特异性RNAi相同的结果,这说明了什么

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Q:各组阴性对照的检测结果是否应该一样如果偏差很大该怎么办

A:正常情况下,各组阴性对照的检测结果应该是相近的。如果偏差过大,只需考虑实验结果的准确性。另外,对于一些特定的基因,比如与细胞难受压力相关的基因,又如参与细胞免疫的基因,可能会对外界压力比较敏感,使得各组对照的基因表达发生变化不一致。

Q:用100nM的siRNA转染时只得到50%沉默效率,我可以把siRNA的浓度增加到200nM甚至400nM吗

A:当干扰效率不佳时,可以在一定范围内适当优化转染浓度,通常优化的范围是10~150nM,但不宜过大,高浓度的siRNA将可能增加非特异性作用的可能性并对细胞产生毒性。

Q:同样的siRNA,为什么在细胞A很有效,在细胞B则没有效果

A:不同细胞的转染效率不一样、基因表达水平也不一样,这些都与siRNA的作用效率有关

siRNA实验方法和设计常见问题解答-答疑集锦-非编码RNA研究策略-锐博技术专题专题—丁香园会议频道()

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