甲基化研究套路

今天运困体育就给我们广大朋友来聊聊广西甲基化热点,希望能帮助到您找到想要的答案。

本文目录导航：

• 1、dna甲基化检测原理及方法？
• 2、甲基化知识点
• 3、又是知道什么是DNA甲基化及其机制？
• 4、[甲基化问题锦集]
• 5、易基因｜全基因组DNA甲基化测序分析全流程

dna甲基化检测原理及方法？

最佳答案DNA甲基化是重要的表观遗传修饰，它涉及到DNA分子上甲基基团的加入。甲基化在基因组稳定性、基因表达调控以及细胞分化和发育等过程中起着关键作用。

DNA甲基化的检测原理主要基于两种方法：甲基化特异性酶切和甲基化特异性结合。

1、甲基化特异性酶切：该方法利用DNA甲基化与未甲基化DNA的敏感性差异，通过特定的限制性内切酶进行酶切反应。未甲基化DNA序列容易被酶切，而甲基化的DNA则不易受酶切。然后，通过聚合酶链反应PCR或者核酸杂交等方法来检测酶切产物，从而确定DNA区域的甲基化状态。

2、甲基化特异性结合：该方法利用DNA甲基化与未甲基化DNA序列的化学结构差异，使用甲基化特异性蛋白质或甲基化特异性抗体与DNA结合。这些蛋白质或抗体可以识别并结合甲基化的DNA区域，然后通过免疫沉淀、荧光等方法来检测甲基化的DNA序列。

常用的DNA甲基化检测方法包括：甲基化特异性PCR（MSP）、全基因组甲基化测序（WGBS）、甲基化敏感限制性内切酶联PCR（MSRE-PCR）、甲基化特异性聚合酶链反等。

DNA甲基化检测方法主要利用DNA甲基化与未甲基化DNA在物理性质或化学性质上的差异，通过特定的实验操作和分析手段，以确定DNA序列的甲基化状态。这些方法在生物医学研究和临床诊断中发挥着重要作用。

甲基化知识点

最佳答案所以首先需要搞清楚什么是表观修饰，表观遗传学，以及为什么关注DNA甲基化这其中一种表观修饰！

表观遗传修饰是指对基因组功能的相关修饰，通过一系列生物学修饰改变基因的活性而不是DNA的核苷酸序列影响基因的表达。对基因组功能的相关修饰主要包括对**DNA、RNA、以及组蛋白等的修饰，这些修饰改变了染色质的局部电化学特性和构象，从而调节基因的转录活性。

其中对 组蛋白修饰 主要是究方法通常是chip-seq技术，我们已经在生信技能树发布了系统性的chip-seq教程，这里就不再赘述。组蛋白是染色质的重要组成部分，主要分为H2A、H2B、H3、H4，与DNA缠绕可形成核小体。 组蛋白修饰 是在组蛋白N末端的氨基酸残基上发生的共价修饰，主要包括甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化、羰基化、糖基化等。

DNA甲基化 是表观遗传学领域一个重要的研究方向，真核生物中最常见的DNA修饰非 5-甲基胞嘧啶（5mC） 莫属了，然而在原核生物中最常见的DNA修饰方式则为 N6-methyladenine (6mA) ，即腺嘌呤第6位氮原子甲基化修饰。

人类是真核生物 ，所以当然是5mC的DNA甲基化形式的检测咯。人的参考基因组约30亿碱基，上面不到1%是 CpG位点，可以被甲基化，也就是说不到3千万个 CpG 位点。这些 CpG 位点中，大约 60~80% 被甲基化。主要是而启动子等特殊区域存在 未被甲基化的CpG 岛，那些区域的CpG 位点比较富集。目前研究表明，肿瘤细胞的甲基化水平平均是低于正常细胞的。

亚硫酸盐是甲基化探测的“金标准”，不管是芯片或者甲基化测序，都要先对DNA样品进行亚硫酸盐处理，使非甲基化的C变成U，而甲基化的C保持不变，从而在后续的测序或者杂交后区分出来。

关于DNA甲基化检测手段介绍，我觉得 Make Decision: DNA甲基化检测方法，哪一款适合你？ 写的就足够好了。同样的，早期研究以芯片为主，从成本的角度来看，也是芯片为主，但是测序数据更丰富。

可选的甲基化芯片产品就少很多，绝大部分是illumina公司产品的，从27K到450K到850K甲基化芯片。比较好的介绍是：Illumina 琪先生 2018-07-17的 一文了解 MethylationEPIC 850K 甲基化芯片

Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片包含了原先的Infinium Methylation450 BeadChip芯片90%的内容，这种选择可提供一种广泛、全面的甲基化组图谱。而且还靶定了ENCODE计划中确定为潜在增强子的区域，还有FANTOM5计划在各种组织类型中确定出的增强子。详细如下：

Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片的数据分析是由GenomeStudio Methylation Module模块所支持，让研究人员能够对小规模研究开展差异甲基化分析。GenomeStudio软件2011.1版特有高级可视化工具，让研究人员能够在单幅图中查看大量的数据，如热图、散点图和线图

甲基化检测方法多达上百种，哪怕是基于NGS的测序技术，也有BS-Seq、MeDIP-Seq、RRBS-Seq、WGBS、MBD-Seq、SMRT 等，我发现 何聪聪 诺禾科服 2016-09-10 介绍的比较齐全，摘抄送给大家，原文在： DNA甲基化研究方法速递

我们我们介绍甲基化测序数据的一般分析流程的时候，主要是针对WGBS技术的数据。

BS-Seq（亚硫酸氢盐测序）有两个缺点：

针对这两个缺陷，科研界一直在尝试研发改进方法。

复旦大学于文强教授团队开发出了一种新的全基因组检测的方法 GPS。该方法利用 T4DNA 聚合酶的 3′-5′外切酶活性和 5′-3′聚合酶活性，使得双端测序的一端是基因组原序列，另一端是转化后的表观序列。该方法极大提高了比对效率和准确性。

当然了，也是可以用低通量手段，专注 特异性位点甲基化检测 ，有：

比如发表在BMC Med. 2009 Oct 的文章Genomic and epigenetic evidence for oxytocin receptor deficiency in autism.里面Gregory等研究者通过 亚硫酸氢盐测序 的方法对119例ASD患者和119名健康人进行了DNA甲基化分析，分析了与调节OXTR表达相关的CPG在外周血和颞叶皮质的甲基化水平，发现ASD患者的CPG甲基化水平在外周血和颞叶皮质均较健康人明显升高。这个研究里面的bisulfite sequencing (BSS)就是低通量，仅仅是关注感兴趣的基因而已：

生物学意义，通常是建议大家看教科书吧，DNA甲基化是最早被发现的表观遗传修饰途径之一，参与许多重要的细胞过程，如基因组印记、X染色体灭活、转录抑制、胚胎发育等，与精神分裂症、Rett综合征、肿瘤等多种疾病的发生和发展密切相关。

尤其是我感兴趣的肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变，其特点是总体甲基化水平的降低与局部甲基化水平的升高。在肿瘤细胞中，癌基因处于低甲基化状态而被激活，抑癌基因处于高甲基化状态而被抑制。

比如： DNA甲基化与肿瘤风险预测

再比如： DNA甲基化推进脑肿瘤的精准分型

还有番茄，玉米的研究，大家自行检索深入学习哦。

当然，更值得一读的是2018年5月， Nature Reviews Molecular Cell Biology 发表的中国科学院上海植物逆境生物学研究中心 朱健康 研究员、 张惠明 研究员与 郎曌博 研究员共同完成的题为“Dynamics and function of DNA methylation in plants”的综述文章。 系统的讨论了植物中DNA甲基化过程。

人体内，DNA甲基转移酶主要有四种：DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L。

因为药物研发也不是我的领域，这里略~~~

随着高通量生物技术（芯片、测序技术）的不断更新发展，高通量的DNA甲基化数据不断涌现，一些大型国际合作的生物大数据计划产生了Pb（petabyte）数量级的甲基化谱。由多个国家和地区的研究机构组成的“国际人类表观基因组同盟”（International Human Epigenome Consortium，简称IHEC）为了研究与人类健康和包括癌症在内的复杂疾病相关的细胞状态产出了超过1000个表观基因组的数据

摘自：

又是知道什么是DNA甲基化及其机制？

最佳答案dna甲基化是最早发现的修饰途径之一，真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶，即在dna甲基化转移酶（dnmts）的作用下的cpg二核苷酸5’端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。大量研究表明，dna甲基化能引起染色质结构、dna构象、dna稳定性及dna与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。dna甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因重新活化和表达。这种dna修饰方式在不改变基因序列的前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物dna甲基化状态与生长发育调控及生理状态密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因cpg岛以外的cpg序列非甲基化程度增加，cpg岛中的cpg则程高度的甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。

原核生物中甲基化多发生在cca/tgg和gatc序列；真核生物中dna甲基化一般发生在cpg位点上；哺乳动物dna甲基化只发生在cpg岛的胞嘧啶，植物甲基化发生在cpg和cpnpg。甲基化会使胞嘧啶转为5-甲基胞嘧啶，cpg位点在基因组是不常见的，主要密集于接近基因启动子的位置，统称为cpg岛。cpg位点的甲基化可以对基因表现有重要的影响。

哺乳动物中，cpg序列在基因组中出现的频率仅有1%，远低于的其它双核苷酸序列。但在基因组的某些区域中cpg序列密度很高，可以达均值的5倍即所谓的cpg岛。通常，cpg岛大约含有500多个碱基，位于基因的启动子区或第一个外显子区。

在哺乳动物基因组中约有4万个cpg岛，而且只有cpg岛的胞嘧啶能够被甲基化。

[甲基化问题锦集]

最佳答案今天和大家聊聊甲基化。

问：什么是表观遗传修饰？

答：基因组表观遗传修饰主要包括DNA甲基化修饰与核小体中组蛋白的修饰等，使得被修饰DNA的空间结构发生改变或使染色体结构发生改变，导致基因的沉默或过度表达。这两种修饰都是在不改变DNA碱基种类与数量的前提下使生物体表型呈现出多样化。

问：什么是DNA甲基化？

答：DNA甲基化是指在DNA 甲基化转移酶的作用下，将甲基选择性地添加到胞嘧啶上形成5’-甲基胞嘧啶的过程。

问：DNA甲基化修饰有什么作用？

答：DNA甲基化是最早发现的一种表观遗传修饰，可能存在于所有高等生物中， 它并不改变基因的碱基序列， 而是通过改变基因的表达影响细胞的功能，与基因沉默、X染色体失活、基因组印记、RNA i以及肿瘤等生物事件密切相关，它们的共同作用机制是调节基因的表达。

问：不同生物，DNA甲基化类型是一样的吗？

答：当然不一样啦。原核生物中甲基化多发生在CCA/TGG和GATC序列，而真核生物中DNA甲基化一般只发生在CpG位点上，哺乳动物DNA甲基化只发生在CpG岛的胞嘧啶，植物甲基化发生在CpG和CpNpG。

问：什么是CpG岛？

答：CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段CpG序列密度很高，可达到均值5倍即所谓的CpG岛。CpG岛主要位于基因的启动子（promotor）和第一外显子区域，约有60%基因的启动子含有CpG岛。CpG岛的GC含量大于50%，经常出现在真核生物的编码基因的调控区。

问：CpG岛为什么要有个"p"，而不叫CG岛？p有什么特殊含意？

答：CpG是胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤的缩写，p代表磷酸。

问：如何预测CpG岛？

答：由于CpG 岛区域较小，研究起来更为方便，因此，众多的研究热点集中在CpG 岛甲基化状态的研究上。而研究CpG岛甲基化的前提条件是确认最合适的CpG 岛区域。

目前有一些网站可以进行CpG岛的预测，我推荐几个比较好用的：

CpG Island（ ）

CpGfinder( )

CpG islands revealing( )

CpGPlot/CpGReport/Isochore( )

然后用实验证实，可以用bisulfite sequencing来比较处理前后的不同，找到甲基化位点。

问：验证特定甲基化位点，并进行甲基化程度分析有哪些方法？

答：采用对照组和实验组样本进行甲基化验证。

(1) MSP方法：可进行特定位点甲基化验证，适用于甲基化芯片后的结果，无法进行甲基化程度分析；

(2) BSP克隆测序法：验证某些相关基因的甲基化位点，并精确计算出甲基化程度百分比；

(3) HRM法：适用于大批量样本甲基化验证，并能计算出甲基化程度范围。

(4) 焦磷酸测序：测序有效长度不超过60bp，精确定量每一个CpG位点。

(5) MassARRAY® 平台：用于单个基因启动子区域的甲基化检测；每个反应覆盖长达500 bp的多个CpG位点； 精准定量每一个CpG位点。

问：刚刚开始研究甲基化，如何寻找甲基化位点？

答：甲基化的研究是近年来较为火热的研究领域之一，您是不是也对它垂涎已久，却苦于无从下手？其实甲基化的研究并没那么难，一句话，还是套路！

首先，甲基化位点的筛选，可以使用全基因组Bisulfite测序（WGBS）、简化基因组甲基化测序（MethylRAD技术）或者甲基化芯片进行基因组整体水平甲基化检测，每种方法各有利弊，要根据实际的研究方向选择不同的方法。对于样品间差异甲基化位点的筛选，可以采用WGBS和MethylRAD技术，其中MethylRAD技术可以应用于无参考基因组的物种，Illumina Methylation EPIC芯片只能用于人类的DNA甲基化水平检测。当然也可以根据一些相关研究显示某些基因存在表达量降低的现象，预测该基因是否存在CpG岛；或者根据文献寻找相关基因的甲基化位点。

其次，对选择的特异位点进行甲基化验证，并进行甲基化程度分析。

最后，根据对照组和实验组样本的检测结果，分析甲基化位点与研究的相关性。

问：只知道基因名称，如何做甲基化检测？

答：只需要将物种及基因信息告知相应或测序公司，会为您提供全方位的检测服务。

原文： 甲基化问题锦集

易基因｜全基因组DNA甲基化测序分析全流程

最佳答案全基因组DNA甲基化实验怎么做？从技术原理、建库测序流程、信息分析流程和研究套路等四方面详细介绍。

表观修饰不需要改变 DNA 序列便能实现对性状的改变，表观修饰的改变与基因功能乃至细胞状态、发育、衰老、疾病等存在重要的关联。在众多的表观遗传修饰中，最为重要且研究最为广泛的修饰之一是 DNA 甲基化，而全基因组甲基化测序（WGBS-seq）无疑是最有效的研究手段。

全基因组甲基化测序利用重亚硫酸盐能够将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为胸腺嘧啶 （T）的特性，将基因组用重亚硫酸盐处理后测序，即可根据单个 C 位点上未转化为 C 未转化为 T 的 reads 数目与所有覆盖的 reads 数目的比例，计算得到甲基化率。该技术对于全面研究胚胎发育、衰老机制、疾病发生发展的表观遗传机制，以及筛选疾病相关的表观遗传学标记位点具有重要的应用价值。

全基因组甲基化测序原理示意图入下：

样品检测——样品打断 ——文库构建——BS处理——文库质检

（一）样品检测

对DNA样品的检测主要包括2种方法：

（1）琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解程度以及是否有污染，检测具有明显的主带，且条带清晰；

Qubit 2.0对DNA浓度进行精确定量，DNA检测总量不低于1ug。

（二）文库构建

样本检测合格后，使用Bioruptor系统将1µg样品基因组DNA与未甲基化的lambda DNA混合，然后将其片段化，平均大小约为250bp。片段化后，纯化的随机片段化DNA随后用T4 DNA聚合酶，Klenow片段和T4多核苷酸激酶的混合物进行修复，钝化和磷酸化末端。随后使用Klenow片段（3'-5'exo-）对钝的DNA片段进行3'腺苷酸化，然后与连接5'-甲基胞嘧啶而不是使用T4 DNA连接酶的胞嘧啶连接的衔接子进行连接。完成每个步骤后，使用磁珠纯化DNA。之后，根据说明使用ZYMO EZ DNA甲基化金试剂盒将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。最后，用JumpStart Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，再使用磁珠对PCR产物进行纯化获得最终文库。

（三）文库质检

文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用qPCR方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度> 2nM），以保证文库质量。

（四）上机测序

文库检测合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后在illumina Nova平台测序，测序策略为PE150。

（一）原始下机数据质控

原始下机数据为FASTQ格式，是高通量测序的标准格式。FASTQ文件每四行为一个单位，包含一条测序序列（read）的信息。该单位第一行为read的ID，一般以@符号开头；第二行为测序的序列，也就是reads的序列；第三行一般是一个+号，或者与第一行的信息相同；第四行是碱基质量值，是对第二行序列的碱基的准确性的描述，一个碱基会对应一个碱基质量值，所以这一行和第二行的长度相同。以下为一条read信息的示例：

原始下机数据包含建库时引进的接头序列以及质量过低的碱基，这些因素会导致后续比对到基因组的reads较少，从而导致得到的信息较少，因此需要进行过滤。利用trim_galore软件对原始数据进行去除接头序列及低质量碱基等质控步骤。

（二）序列比对

经过质控的reads需要根据与参考基因组的序列相似度比对到参考基因组上。相比于常规基因组及转录组测序，WGBS测序方法产生的数据的特点决定其在比对时存在三大困难：

（1）DNA片段正链和负链经过重亚硫酸盐转化后将不再反向互补，再经过PCR，便会产生四条不同的序列，这将大大增加比对时的计算量。

（2）经过重亚硫酸盐转化后，DNA序列大部分C碱基被转化成T碱基，因此序列含大量T而缺乏C；经过PCR后，产生的互补链则含有大量A而缺乏G。这样便导致序列的复杂度降低（即序列的组成特征更单一），从而增加比对的难度。

（3）C和T的比对是不对称的。经过重亚硫酸盐转化后，序列中非甲基化的C碱基（占大部分）被转化为T，这将导致测序序列与参考基因组不匹配，T既可能应该比对到T上，有可能应该比对到C上；而C则只能比对到C上。这也增加了比对的难度。

利用BSMAP软件进行比对。BSMAP进行比对时，先以参考基因组上C碱基的位置作为指导，将reads中对应参考基因组C碱基位置的T标记为C，其他T保持不变，从而使reads可以直接比对到参考基因组。

（三）甲基化水平计算

甲基化水平可根据未转化为 T 的 C 与转化为 T 的 C 的 reads 的比例计算得到，即：

Beta-value = C-reads / (C-reads + T-reads) * 100%

其中，Beta-value 即为该胞嘧啶的甲基化水平，C-reads 为覆盖该位点的支持甲基化的reads 数目（测得该位点为 C 的 reads），T-reads 为覆盖该位点的不支持甲基化的 reads 数目（测得该位点为 T 的 reads）。 计算原理示意图如下：

利用BSMAP统计甲基化水平。

（四）差异甲基化区域（DMR）鉴定及统计

DMR检测使用权威期刊发表的metilene软件。该软件先将基因组进行预分段，以排除较长序列中不包含CG位点的片段。随后，利用二元分隔算法，递归缩小检测范围，以搜索得到组间累积平均甲基化差异最大的区域，作为可能的DMR；最后，结合双重统计学检验（MWU-test和2D KS-test），得到准确的DMR。检测原理如下图所示：

本分析检测DMR的标准如下：

（1）区域平均甲基化差异不小于0.1；

（2）CpG位点数不少于5个；

（3）区域长度不小于50 bp；

（4）甲基化水平差异统计检验的校正P值小于0.05；

（5）2D KS-test检验P值小于0.05。

（五）信息分析流程示意图

DNA甲基化组学研究的核心内容在于对DNA甲基化数据的挖掘。DNA甲基化一般遵循三个步骤进行数据挖掘。

首先，进行整体全基因组甲基化变化的分析，包括平均甲基化水平变化、甲基化水平分布变化、降维分析、聚类分析、相关性分析等。

其次，进行甲基化差异水平分析，筛选具体差异基因，包括DMC/DMR/DMG鉴定、DMC/DMR在基因组元件上的分布、DMC/DMR的TF结合分析、时序甲基化数据的分析策略、DMG的功能分析等。

最后，将甲基化组学&转录组学关联分析，包括Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、网络关联等。

Whole-Genome Bisulfite Sequencing of Two Distinct Interconvertible DNA Methylomes of Mouse Embryonic Stem Cells. 两种状态的小鼠胚胎干细胞的甲基化组学研究

1、背景

小鼠胚胎干细胞一般生长在含有血清的基质中，被称作血清干细胞(serum ESCs)；加两种激酶抑制因子使胚胎干细胞在无血清的情况下更能保持多能性的基态，这种干细胞称为2i干细胞(2i ESCs)；这两种状态的胚胎干细胞可以互相转化。以前这方面的甲基化研究大多基于质谱，覆盖度和研究结果有限，尚缺乏2i胚胎干细胞的甲基化组学研究。

2、方法

利用全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS），对这两种可互相转换的小鼠胚胎干细胞进行甲基化组学研究

3、结论

全面准确的检测了两种小鼠胚胎干细胞的DNA甲基化修饰并进行了系统的比较；同serum ESCs相比，雄性2iESCs全局低甲基化；在血清中，雌性ESCs跟雄性2i ESCs类似呈现全局低甲基化，而在2i ESCs状态下，甲基化水平会进一步降低。

就是关于全基因组甲基化测序实验流程和分析思路的介绍。

参考文献：

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[3] Frank Jühling et al. metilene: Fast and sensitive calling of differentially methylated regions from bisulfite sequencing data. Genome Research, 2016, 26: 256-262.

[4] Kanehisa M, Goto S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic acids research, 2000,28(1): 27-30.

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[6] Xiaojing Yang et al. Gene Body Methylation Can Alter Gene Expression and Is a Therapeutic Target in Cancer. Cancer Cell 26, 577–590.

[7] Yuanxin Xi et al. BSMAP: whole genome bisulfite sequence MAPping program. BMC Bioinformatics, 2009, 10:232.

[8] Gao F, et al. De novo DNA methylation during monkey pre-implantation embryogenesis. Cell Res. 2017 Apr;27(4):526-539. pii: cr201725.

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