「陕西甲基化利器」甲基化研究的最新进展

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本文目录导航：

• 1、易基因 | 精准医学：DNA甲基化图谱在发现和精确诊断神经肿瘤领域的应用
• 2、RNA甲基化专题 | 癌症研究篇
• 3、单细胞DNA甲基化研究基础篇：从实验策略到数据分析方法简介
• 4、甲基化对生物体有什么危害啊？
• 5、什么是dna甲基化修饰？其生物学意义是什么

易基因 | 精准医学：DNA甲基化图谱在发现和精确诊断神经肿瘤领域的应用

近年来，中枢神经系统(CNS)肿瘤的分类变得更加客观、更依托生物学认知。虽然过去的分子诊断包括特定突变、拷贝数变化或基因融合，但DNA甲基化测序的发展显著提高了诊断精度，增加了可靠性，并为发现新的肿瘤类型提供了思路。在大多情况下，基因突变/融合与DNA甲基化间存在着密切关系。在这篇综述中，作者强调了DNA甲基化图谱在中枢神经系统肿瘤分类中的作用，重点介绍了几种肿瘤类型，以及DNA甲基化图谱对目前肿瘤分类的贡献。

CpG 甲基化测定

有多种方法可以量化DNA甲基化，每种方法在临床肿瘤学中都有不同的应用。限制性内切酶酶切、亲和富集方法，如甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)和电化学检测都是用于测定全基因组甲基化的方法。基因组DNA的重亚硫酸盐测序是最常用的方法，重亚硫酸氢钠可以将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，除此之外还有全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS)技术。图1概述了目前DNA甲基化图谱的诊断应用及其在外科神经病理学中的作用。

生物信息分析

为了将甲基化阵列数据转化为实际应用，需要执行各种分析和计算步骤。用甲基化数据描述肿瘤类型的一个比较常见和实用的方法是降维。类似于主成分分析(PCA)，这些算法将高维数据(例如，数千个脑瘤样本，每个样本具有约20-30k数据)降至低维(2或3)以便于可视化(图2)。

值得一提的是，甲基化阵列数据中还可以获得其他对诊断有帮助信息。人们很早就认识到甲基化和非甲基化信号强度的总和可以用来推断全基因组的拷贝数，分段的拷贝数数据以及拷贝数断裂点的分析也会对诊断和基因融合的判断起到帮助作用。

诊断准确性及其对临床结果的影响

截止到目前，甲基化图谱已经识别出多个新的中枢神经系统肿瘤类型和亚型，其中许多都与临床病程和临床结果有着重要的关联。在临床中，甲基化数据分析在很多病例诊断结果的确定上起到了重要的辅助作用。

基于的临床检测出的差异甲基化数据，从前被归类为原始神经外胚层肿瘤现在被分类成多个不同的肿瘤类型，这些肿瘤包括具有高频率C19MC改变的多层菊形团胚胎性肿瘤(ETMR)，具有 FOXR2 激活的中枢神经母细胞瘤(CNS-NB-FOXR2)，BCOR串联重复的CNS肿瘤(CNS-BCOR-ITD)。总体而言，基于DNA甲基化数据的非监督分析对于CNS-PNET亚型间的区别具有重要的临床意义。

新型和罕见的肿瘤类型

除了在识别常见的中枢神经系统肿瘤类型方面的优势外，甲基化特征分析的一个新的优势是它能够发现新的肿瘤类型，并提供现有类型的确认/改进。例如， IDH1/2 突变定义了一个广泛的弥漫性胶质瘤亚型，这些亚型在临床和分子上与异柠檬酸脱氢酶(IDH)野生型弥漫性胶质瘤不同，这种遗传差异通过DNA甲基化图谱得到证实。甲基化图谱针对对于许多新的肿瘤类型在很大程度上已经成为了一种发现工具。

胶质瘤（Gliomas）

毛细胞型星形细胞瘤(HGAP)包括一个独特的甲基化群，包括 ATRX、TERT 启动子突变； CDKN2A/B 缺失/突变、 CDK4 扩增； NF1 缺失/突变、 BRAF 融合等。组织学表现与其他胶质瘤有很大重叠，HGAP多见于年轻人(中位年龄40岁)，主要见于颅后窝。值得注意的是，HGAP在儿童(0-16岁)中发病是比较罕见的，这个年龄段的大多数形态学诊断的“毛细胞型星形细胞瘤伴间变”与其他甲基化类别聚集在一起，包括毛细胞型星形细胞瘤和IDH-野生型GBM。

目前，甲基化图谱是诊断这种肿瘤类型的唯一方法。在HGAP中发现的基因改变(如 CDKN2A/B 纯合缺失、 ATRX 突变、 BRAF 融合)是非特异性的，可见于其他中枢神经系统肿瘤类型。然而，检测到这些基因改变，就应该引起对HGAP的怀疑。临床上，HGAP与其他高级别胶质瘤的区别很重要，因为HGAP的预后比PA和PXA更具侵袭性，但总体存活率明显高于IDH-野生型GBM。HGAP被误诊为GBM的情况并不少见，精准诊断在临床上具有十分重要的意义，因此将组织学相似的肿瘤分解为生物学和临床相关的类型是DNA甲基化分类的显著优势之一(图3)。

神经胶质瘤（Glioneuronal Tumors）

弥漫性胶质神经元瘤具有少突胶质瘤样特征和核簇(DGONC)是最近提出的一种通过甲基化定义的肿瘤类型，它是通过对>25000个中枢神经系统肿瘤的非监督聚类而发现的。DGONC的组织学表型可能与其他肿瘤类型有显著重叠，包括少突胶质细胞瘤和CNS-PNET。在低级别胶质细胞或神经胶质细胞肿瘤中常见的遗传学改变，如FGFR1和BRAF，尚未在测序病例中发现。由于这种肿瘤类型的遗传驱动因素尚未阐明，DNA甲基化图谱仍然是检测其的唯一方法。在低级别胶质细胞或神经胶质细胞肿瘤中，典型的遗传学改变，如 FGFR1 和 BRAF ，尚未在测序病例中被发现。由于这种肿瘤的遗传驱动因素尚未明确，DNA甲基化图谱仍是其检测的唯一方法。

胚胎肿瘤（Embryonal Tumors）

多层菊形团胚胎性肿瘤(ETMR)是一种高度分级(WHO 4级)的原始中枢神经系统肿瘤，具有明显的组织学特征。ETMR甲基化图谱显示与其他中枢神经系统肿瘤类型明显分离，并形成一个相对同质的群体，无论是C19MC扩增还是 DICER1 突变状态。绝大多数病例存在多层菊形团和神经纤维团混合区域的特征性组织学特征。结合LIN28A免疫组织化学，在显微镜下即可作出诊断。尽管LIN28A具有很高的敏感性，但它的表达不是ETMR所特有的，在AT/RT、生殖细胞肿瘤和HGG中已有报道。因此，DNA甲基化分析是诊断ETMR的一种特异性方法，与潜在的组织病理学或基因突变无关，同时基于甲基化的拷贝数评估也可以作为识别潜在亚型的有用特征。

这些肿瘤类型之间的区别在临床上十分重要，通常可以通过组织病理学和影像学来解决。然而，非典型病例可能会造成诊断困难。AT/RT和PDC(脊椎)的平均OS分别为14.4个月和51个月(AT/RT不同亚型的生存期不同）。CRINET和DMT的生存数据有限，但已报道的平均OS分别为125个月(AT/RT-TYR为37个月)和36个月。尽管有共同的基因改变，AT/RT、PDC和DMT的DNA甲基化特征还是具有明显特异性的(图2)。到目前为止的数据表明，DNA甲基化图谱可以区分可能会构成诊断问题的大多数 SMARCB1 失活的中枢神经系统肿瘤。

间充质肿瘤（Mesenchymal Tumors）

伴有 CIC 基因重排的肉瘤是一种罕见的高级别间叶性肿瘤，同时发生于中枢和中枢神经系统外。在组织学上，伴有 CIC 基因重排肉瘤的特点是肿瘤细胞形态呈梭形或圆形，高度恶性(增殖、坏死)，并有数量不等的粘液基质。特征性的基因改变是 CIC 与各种配对基因的易位，导致作为显性癌基因的融合。在中枢神经系统中，最常见的是 CIC-NUTM1 融合，由t(15；19)易位。在 CIC 融合阳性的病例中，有14%的 CIC 裂解FISH呈假阴性。此外，在融合阴性的病例中也发现了 CIC 突变。最近的一份报告还指出，出现了涉及 ATXN1 和 DUX4 的非 CIC 融合基因。在甲基化图谱上根据 CIC 基因将肉瘤重新分成不同的组，与潜在的融合基因/突变或解剖部位无关(图2)。

DICER1 突变的原发性颅内肉瘤是一种新发现的高度恶性肉瘤，由染色体14q32.13上 DICER1 基因的体细胞或胚系突变所定义。发生在胚系 DICER1 突变背景下的肿瘤可能代表遗传性或综合征性关联(即 DICER1 综合征)。胚胎型横纹肌肉瘤的组织学特征常见于肌源性分化、形态学和免疫表型重叠。因此，初步命名为“具有横纹肌肉瘤样特征的梭形细胞肉瘤， DICER1 突变体”。 DICER1 突变的颅内肉瘤的组织学表现没有特异性，可能与其他肉瘤如滑膜肉瘤、纤维肉瘤和胶质肉瘤重叠。而DNA甲基化分析可以很容易地将 DICER1 突变的原发性颅内肉瘤与其它肿瘤类型区分开来。然而，还需要进一步的研究来评估DNA甲基化分析是否能将其与转移性 DICER1 突变肿瘤区分。

已建立的中枢神经系统肿瘤的表观遗传学亚型

作者在这篇文章中还提供了DNA甲基化图谱对已建立的世卫组织中枢神经系统肿瘤亚型的贡献的例子。世界卫生组织对中枢神经系统肿瘤的第5版分类预计将包括更多分子定义的亚型。甲基化阵列分析已被证明能有效地识别并在某些情况下定义这些亚型。

易基因小结

将DNA甲基化分析整合到中枢神经系统肿瘤的常规检查中，可以提高诊断的准确性以及实现明确肿瘤类型的临床意义。捕捉原发性中枢神经系统肿瘤的遗传异质性是DNA甲基化图谱最大的优势。尤其在组织学上不明确的肿瘤类型中具有重要价值，这些肿瘤类型可能含有靶向改变(例如，IHG)。DNA甲基化在确认组织学诊断方面的可靠性已经得到证实。

在骨骼和软组织病理学中实施的基于DNA甲基化阵列的分类可能预示着其他疾病领域得检测也会发生类似的转变。在通过TCGA分析的33种癌症中，全基因分子图谱显示了基于DNA甲基化数据的无监督聚类的所有类型中具有生物学或预后意义的亚群，进一步强调了DNA甲基化在其他癌症中的潜在临床应用价值。鉴于中枢神经系统肿瘤诊断对甲基化特征的日益依赖及其在临床分类标准中的应用，在诊断神经病理学的实践中，特别是对于罕见的中枢神经系统肿瘤，有必要进一步研究和利用DNA甲基化检测这一对临床诊断有巨大帮助作用的技术。

RNA甲基化专题 | 癌症研究篇

m6A RNA甲基化是最常见、最丰富的真核生物mRNA转录后修饰。研究表明，m6A 在不同组织，细胞系中是一个复杂的调控网路，m6A RNA 甲基化参与 RNA 的代谢过程，并与肿瘤的发生和发展密切相关。本期着重解读两篇癌症中的 m6A 研究，看一下 m6A RNA 甲基化如何玩转高分期刊。

2020年10月，南京医科大学汪秀星课题组和美国 UCSD Jeremy Rich 等课题组在Cancer Discovery上发表题为“The RNA m6A reader YTHDF2  maintains oncogene expression and is a targetable dependency in glioblastoma stem cells”的研究论文。该研究为靶向治疗胶质母细胞瘤提供了新的治疗机会。

研究背景

胶质母细胞瘤（GBM）代表了最常见的原发性，内在性脑肿瘤，患者的平均生存期限制在一年。鉴于胶质母细胞瘤干细胞（GSC）在治疗抗性，血管生成，免疫逃逸和侵袭中的作用，临床和临床前观察表明，靶向GSC可以改善肿瘤预后神经肿瘤学上的精准医学研究。

研究方法

研究结果

1. 在 GSC 中上调的致癌转录本以 RNA m6A 修饰为标志

作者利用 MeRIP-seq 对 GSC 和神经干细胞（NSC）进行 m6A 标记的检测，结果发现，与非肿瘤对应物相比，GSCs 的m6A 分布发生了改变。通过38个 GSCs 和5个 NSCs 的队列中的 RNA-seq 数据进行 GSEA 分析，具有 m6A 峰的基因在GSC 高度富集，而且在 GSC 中获得的具有 m6A 峰的基因均被上调。相反，相对于 NSC、GSC 中丢失 m6A 峰的基因通常在 GSC 中被下调。而且，在 GSC 中，与癌症干细胞相关的重要基因上获得了 m6A 峰，包括表达增加的 OLIG2  和 MYC 。

2.  YTHDF2  在 GSC 中表达上调，对 GSC 的维持至关重要

作者为研究 m6A YTHDF  在胶质母细胞瘤中的功能作用，利用 CRIPR 技术检测了 YTHDF2 ，相对于对照 sgRNA，敲除 YTHDF2  会降低细胞活力及减少 GSCs 中细胞球形成。为研究了 YTHDF2  耗竭是否会诱导 GSC 分化，正交实验发现，shRNA 介导的 YTHDF2  敲低会降低 GSC 的活性，过表达的 YTHDF2  可以挽救 GSC 的活性。结果表明， YTHDF2  是胶质母细胞瘤维持的一个特异性和有效的调节因子。

3.  YTHDF2  通过 m6A RNA 修饰支持 GSCs 中的基因表达

作者利用 RNA-seq 检测 YTHDF2  的下游靶点，敲除 YTHDF2  可引起 GSCs 中广泛基因表达的改变， MYC  靶点显著富集，而且，GSCs 中获得 m6A 峰的基因更频繁地下调。通过 qPCR 也验证了 YTHDF2  敲除对 MYC、VEGFA  mRNA 水平降低的作用。为了预测 YTHDF2  在 GSCs 中的作用，作者结合 TCGA 胶质母细胞瘤基因表达数据，发现 YTHDF2  相关基因 MYC  和 E2F  靶点以及 G2M  调节因子和氧化磷酸化介质高度富集。这些数据表明 YTHDF2  作为与 m6A 差异修饰相关的转录程序的调节因子。

4.  YTHDF2  通过保持  MYC  转录稳定发挥 GSC 特异性依赖作用

为了确定 YTHDF2  介导作用于 GSCs 中 MYC 的特异性，作者比较了在 NSCs 和 GSCs 之间 YTHDF2  缺失的影响。NSCs 中 YTHDF2  敲低并不影响 MYC mRNA 水平，但降低了 GSCs 中 MYC mRNA 水平。而且， YTHDF2  耗竭降低了GSC 的活性，而不影响 NSCs。因此， YTHDF2  代表了一种 GSC 特异性依赖，通过 MYC  基因的特异性稳定支持胶质母细胞瘤的生存。

5.  IGFBP3  是 GSCs 中  YTHDF2-MYC  轴的下游靶点

因为 IGFBP3  是 YTHDF2  耗尽后最高下调基因之一，作者研究了 IGFBP3  是否调控 YTHDF2-MYC  轴下游的细胞活力。 IGFBP3  的缺失降低了 GSC 的活性和细胞球形成。 IGFBP3  过表达挽救了 GSCs 免于 YTHDF2  下调介导的细胞死亡。最后，作者利用20个胶质母细胞瘤和20个非肿瘤脑组织中 IGFBP3  的表达进行验证，观察到 GSC 中 IGFBP3  mRNA 表达升高。结果表明， IGFBP3  是 GSCs 中 YTHDF2-MYC  信号轴的关键下游效应子。

6.  YTHDF2-MYC-IGFBP3  轴促进体内肿瘤生长

为了探讨在体内靶向 YTHDF2  治疗的潜在益处，作者利用 CRISPR 敲除技术对原位异种移植物的小鼠进行检测。结果表明，与携带对照 sgRNA 的 GSCs 的小鼠相比，敲除 YTHDF2  延长了肿瘤潜伏期并减少了肿瘤体积。 IGFBP3 过 表达恢复了 YTHDF2  缺失的 GSCs 体内成瘤能力。

研究结论

通过结合体外和体内的 GSCs 研究，该研究阐明了 m6A 介质在 GSCs 中的功能，并确定 YTHDF2  是 GSCs 特异性依赖，通过稳定 MYC  转录物调控 GSCs 中的葡萄糖代谢。这些发现为靶向治疗胶质母细胞瘤提供了新的治疗机会。

2020年4月，上海交通大学医学院附属仁济医院洪洁团队在 Molecular Cancer 上发表了题为“m6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression”的研究论文。研究表明，靶向 METTL3  及其通路为高糖代谢的 CRC 患者提供了另一种合理的治疗靶点。

研究背景

结直肠癌 (CRC) 是全球第四大常见恶性肿瘤和第三大癌症死亡原因，而以乳酸作为糖酵解的最终产物，被认为是治疗癌症的一种有前途的方法。m6A 调控基因的改变在多种人类疾病的发病机制中起着重要的作用，但 m6A 修饰是否在 CRC 的葡萄糖代谢中起作用尚不清楚。

研究方法

研究结果

1.  METTL3 与结直肠癌糖酵解密切相关

为了探讨结直肠癌（CRC）中 m6A 修饰与糖酵解代谢之间的相关性，作者对47例 CRC 患者进行 RT-PCR分析，CRC患者中FDG 摄取与 METTL3  表达之间存在最显着的相关性。进一步分析发现 CRC 患者中 FDG 摄取与 METTL3  免疫组化染色存在显著相关性。最后，作者利用 RNA-seq 比较 METTL 3 敲除和野生型(WT) HCT116 CRC 细胞的基因表达谱， METTL3 敲除细胞表现出更高的 METTL3 表达。这些结果表明 METTL3  可能介导 CRC 患者糖溶解代谢和癌变。

2. METTL3  在结直肠癌中促进糖酵解代谢

为了弄清 METTL3  的改变是否直接影响糖酵解代谢，研究发现敲除 METTL3  可显著降低 HCT116 和 SW480 细胞的胞外酸化速率(ECAR)水平，过表达 METTL3 显著提高了 DLD1 细胞的乳酸生成、葡萄糖吸收和 ECAR  水平。为了阐明 Mettl3  诱导的 CRC 糖酵解是否依赖于其甲基转移酶功能，作者通过 Mettl3  野生型和突变型的研究，发现 Mettl3  的 MTase 结构域的缺失阻断了 Mettl3  诱导的糖酵解过程。这些数据表明 Mettl3 通过其甲基转移酶结构域调控结直肠癌糖酵解代谢。

3. 在结直肠癌中， METLC3  诱导的增殖依赖于糖酵解的激活

METLC3  的敲除消除了 HCT116 细胞的细胞增殖和集落形成，并且降低了 HCT116 肿瘤的生长和异种移植小鼠模型中的肿瘤重量。在功能分析中， METTL3  的过表达增加细胞增殖、集落形成、肿瘤的生长和肿瘤的重量。2-DG（糖酵解途径的抑制剂）处理在体外和体内显着阻断了 METTL3  诱导的细胞增殖和菌落形成，这些结果表明 Mettl3 通过调控结直肠癌糖代谢促进 CRC 进展。

4. METTL3  在结直肠癌中的潜在靶点

为了鉴定 METTL 3 的潜在靶标，作者选择了 METTL3  敲除和 WT HCT116 细胞进行 MeRIP-seq和RNA-seq，最常见的motif ' GGAC '在 m6a 峰中显著富集，大部 分 METTL3  结合位点位于 CDS区，在 5'UTR 和 3'UTR 高度富集，并且 m6A在转录水平上发生了全局低甲基化。联合RNA-seq数据，确定了429个低甲基化的 m6A 基因，其 mRNA 转录被下调，595个低甲基化的 m6A 基因，其 mRNA 转录被上调。基于甲基化水平与 mRNA 表达水平都下降，找到与糖酵解密切相关的靶基因 HK2  和 SLC2A1(GLUT1) 。

6.  HK2  和  SLC2A1  是  METTL3  在 CRC 中重要的功能靶基因

作者通过 HCT116 WT 和 mettl3  敲除细胞转染 control、 HK2  或 SLC2A1  过表达实验发现， HK2  或 SLC2A1  的异位表达部分恢复了敲除 mettl3  细胞的增殖、集落形成能力和肿瘤生长，而且，也能恢复 HCT116 mettl3  敲除细胞中乳酸产量的下降。同时，在体外和体内，过表达 SLC2A1  显著恢复了 HCT116 mettl3  敲除细胞葡萄糖摄取下降的趋势。因此， HK2  和 SLC2A1 介导了 CRC 细胞中 METLL3 的调节功能。

研究结论

METTL3  是 CRC 的一种功能性和临床致癌基因。 METTL3  通过 m6A- IGF2BP2/3— 依赖机制稳定 CRC 中 HK2  和 SLC2A1 的表达。靶向 METTL3  及其通路为高糖代谢的 CRC 患者提供了另一种合理的治疗靶点。

参考文献

[1] Dixit D, Prager B, GimpleShen R, et al. The RNA m6A reader YTHDF2  maintains oncogene expression and is a targetable dependency in glioblastoma stem cells[J]. Cancer Discovery, 2020.

[2] Shen C, Xuan B, Yan T, et al. M6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression[J]. Molecular Cancer, 2020, 19(1).

单细胞DNA甲基化研究基础篇：从实验策略到数据分析方法简介

DNA甲基化是细胞分裂过程中遗传的一种表观遗传标记，影响细胞的生物学功能。而单细胞水平上的全基因组甲基化分析将有助于深入了解转录调控和细胞异质性。

单细胞DNA甲基化研究怎么做？

来自韩国的科研人员在《 Biomolecules 》发表综述文章， 介绍了单细胞DNA甲基化分析方法，包括实验策略和数据分析；此外，还介绍了相关科研应用并讨论了未来的发展。

注：此篇综述没有介绍5mC分析方法，虽然介绍了许多多组学方法，但每种方法的单独分析过程未作深入讨论。

亚硫酸氢盐转化法被认为是DNA甲基化分析的金标准。 由于它的高转化率（>99%）、可重复性和通过商业试剂盒的简单易用性而受到研究人员的青睐。然而，亚硫酸氢盐转化法采用了导致DNA降解的苛刻反应条件，PBAT的开发即是为了解决降解造成的损失问题。

RRBS和WGBS是流行的全基因组甲基化分析方法。 这两种方法都包括亚硫酸氢盐转化和NGS制备。主要区别在于，RRBS使用适当的限制性内切酶和大小选择来筛选富含GC的区域。WGBS（特别是MethylC-seq）的优势在于能够覆盖基因组中的大部分CpGs。与RRBS相比，WGBS的纯化和筛选过程相对简单。在WGBS中防止亚硫酸氢盐转化过程中的降解损失被认为是相对重要的，因此许多基于WGBS的单细胞方法往往是基于PBAT的。

多组学方法是根据甲基化分析方法与其他分析方法（RNA、染色质可及性）相结合来区分的。 例如scM&T-seq是基因组和转录组测序（G&T-seq）与scBS-seq的结合，G&T-seq是一种基于Smart-seq2识别DNA和RNA的方法。此外，应用于单细胞甲基化分析方法的技术，如PBAT，也可以类似地应用于NOME-seq，NOMe-seq可以根据核糖体的存在与否，利用GpC甲基转移酶的染色质可及性差异，确认双硫酸盐转化的DNA中开放染色质和CpG甲基化。scCOOL-seq、iscCOOL-seq和scNome-seq可以一起监测染色质可及性和CpG甲基化。

通过转化以外的方法观察甲基化主要分为两类：利用甲基胞嘧啶的亲和结合和利用限制性内切酶对甲基胞嘧啶的敏感性。MBD-seq和MeDIP-seq是具有代表性的基于亲和性的方法。 基于亲和力的方法不适合在单细胞规模上应用 ，因为这些方法基于DNA片段产生平均DNA甲基化谱，这不允许区分单个细胞中DNA甲基化模式的差异。然而，与基于亲和力的方法不同， 基于MSRE的方法可以被改进， 使用MSRE的单细胞方法的细化可以在Methyl-seq中看到，scCGI-seq测量甲基化的方式与Methyl-seq类似。

在测序实验之后，包括RRBS或WGBS，需要对数据进行预处理。预处理步骤可分为 数据质控（QC）、序列修剪和比对 ，例如使用 FastQC 测量总体的基本测序数据质量，使用 Trim Galore！、fastp和Trimmomatic 等软件修剪，下表列出了常用的比对工具。

甲基化分析的主要目的是探索构成样本、器官和疾病状态（包括癌症）之间差异的表观遗传学证据。为了发现这些差异，需要一个暗示此概念的数值，一个广泛使用的术语是β值。在甲基化调用后，进行后续分析，如可视化分析的t-SNE，聚类分析，以及识别差异甲基化胞嘧啶（DMCs）或差异甲基化区域（DMRs）

上述方法主要依赖于单个CpG位点的甲基化水平。最近的甲基化分析利用了每个reads的甲基化模式来诊断疾病，尤其是癌症。这种新的分析概念是基于甲基化的生物学特性，即除非出现从头甲基化，否则相邻CpG位点之间有保持甲基化的趋势。 该读取模式方法能够检测具有疾病信号的DNA分子，并且具有增加疾病信号检测机会的可能性。 例如，一项大型液体活组织检测研究设计了一个集成分类器，根据读取模式分析对肿瘤类型进行分类，并在早期癌症的检测中显示出显著的结果。此外，通过甲基化模式对肿瘤衍生的DNA分子进行量化是观察肿瘤负担的另一种方法。

生殖细胞或胚胎细胞的成熟受到特定基因表达的影响，这与DNA中的甲基化水平相关。例如基于植入前的胚胎细胞的甲基化特征，利用单细胞甲基化测序，通过对早期胚胎系追踪的研究，研究植入前细胞甲基化的机制及其现象。研究团队观察到非CpG甲基化在卵母细胞成熟过程中不断积累，说明非CpG甲基化与CpG甲基化在卵母细胞成熟过程中的作用不同。

在疾病患者中，DNA甲基化的模式与健康人不同。在各种疾病中，癌症尤其具有正常细胞所不具有的DNA甲基化模式，从而导致基因表达水平的差异。在对具有这种异质性的癌症研究中，需要使用多组学方法，将基因组变异和RNA表达结合起来进行分析。例如一个研究小组最近开发了一种称为scTrio-seq2的方法，它整合了单细胞转录组和单细胞甲基化测序数据。多项研究表明使用单细胞甲基化测序（sc-methyl-seq）的多组学方法可以克服先前方法的局限性，并且具有更好的鉴别能力。因此，sc-methyl-seq可用于各个领域，以解决与生物过程和疾病相关的基本问题。

单细胞DNA甲基化研究仍存在一些问题。其中第一个问题是亚硫酸氢盐转化的降解问题，这是目前的金标准。然而，在数量有限的单细胞尺度上，由于降解而造成的损失比在体积尺度上更严重。为了解决这个问题，采用了PBAT等技术，但其性能无法与使用大量DNA的方法相比。近年来，利用TET酶活性的方法，如TAPS和EM-seq，已经被开发出来，并作为一种解决慢性降解问题的方法而受到关注。另一个问题是一个明确的标准分析过程还没有建立。由于这些挑战，目前最好的方法是引入多组学方法进行交叉验证。

随着数据采集的成本正在逐渐降低和数据联盟的建立（例如国际人类表观基因组联盟（IHEC）等），全面数据的积累可以提供一个了解甲基化的机会。关于甲基化证据的积累将使大家有可能找到因不同组织类型、不同实验或环境条件以及异质性疾病（如癌症）而波动的甲基化热点区域。此外，通过积累的数据发现细胞类型的特异性标记，将有利于通过单细胞DNA甲基化数据的可视化来进行细胞异质性分析，包括在t-SNE图中分配细胞集群。相信对甲基化及其在疾病中的生物学作用之间关系的理解将随着未来进一步的数据而得到揭示。

首发公号：国家基因库大数据平台  

参考文献

Ahn J, Heo S, Lee J, et al. Introduction to Single-Cell DNA Methylation Profiling Methods[J]. Biomolecules, 2021, 11(7): 1013.

甲基化对生物体有什么危害啊？

甲基化是先影响转录，后影响翻译。

甲基化修饰一般不会影响遗传物质的表达，除非人工改造等的特殊情况，因转录在前，翻译在后，所以先影响转录，后影响翻译。

甲基化的概念：

甲基化，是指从活性甲基化合物上将甲基催化转移到其他化合物的过程，可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。在生物系统内，甲基化是经酶催化的，这类涉及重金属修饰、基因表达的调控、蛋白质功能的调节以及核糖核酸加工。

甲基化的类型：

甲基化包括DNA甲基化和蛋白质甲基化。

1、DNA甲基化：脊椎动物的DNA甲基化一般发生在CpG位点（胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点，即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点）。

经DNA甲基转移酶催化胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。人类基因中约80%-90%的CpG位点已被甲基化，但是在某些特定区域，如富含胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG岛则未被甲基化。这与包含所有广泛表达基因在内的56%的哺乳动物基因中的启动子有关。

1%-2%的人类基因组是CpG群，并且CpG甲基化与转录活性成反比。

2、蛋白质甲基化：蛋白质甲基化一般指精氨酸或赖氨酸在蛋白质序列中的甲基化。精氨酸可以被甲基化一次（称为一甲基精氨酸）或两次（精氨酸甲基转移酶（PRMTs）将两个甲基同时转移到精氨酸多肽末端的同一个氮原子上成为非对称性甲基精氨酸。

或者在每个氮端各加一个甲基成为对称性二甲基精氨酸）赖氨酸经赖氨酸转移酶的催化可以甲基化一次、两次或三次。

在组蛋白中，蛋白质甲基化是被研究最多的一类。在组蛋白转移酶的催化下，S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到组蛋白。某些组蛋白残基通过甲基化可以抑制或激活基因表达，从而形成为表观遗传。蛋白质甲基化是翻译后修饰的一种形式。

什么是dna甲基化修饰？其生物学意义是什么

DNA甲基化为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团。

意义：大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。

DNA甲基化反应分为2种类型。一种是2条链均未甲基化的DNA被甲基化，称为从头甲基化；另一种是双链DNA的其中一条链已存在甲基化，另一条未甲基化的链被甲基化，这种类型称为保留甲基化。

扩展资料：

DNA甲基化同组蛋白甲基化共同调控基因表达的现象最早在链孢霉中得到证实，进一步的生化研究结果表明，DNA甲基化是受组蛋白甲基化调节的。对哺乳动物的研究发现，DNA甲基化是建立和维持其他表观遗传学现象的基础。

比如DNA甲基化位点可以募集诸如组蛋白去乙酰化酶等具有抑制功能的复合物，同时除掉该位点附近的组蛋白乙酰化标记。也有研究认为，DIA甲基化是受组蛋白修饰调控的，有报道称组蛋白修饰H3K9me能够促进DNA甲基化的进程。

参考资料来源：百度百科-DNA甲基化

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