甲基化应用

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• 1、易基因 | 精准医学：DNA甲基化图谱在发现和精确诊断神经肿瘤领域的应用
• 2、硫酸二甲酯什么时候与酚反应什么时候与醇反应
• 3、WGBS vs RRBS
• 4、甲基电子式是什么？
• 5、免疫组化检查和宫颈甲基化检查区别

易基因 | 精准医学：DNA甲基化图谱在发现和精确诊断神经肿瘤领域的应用

最佳答案近年来，中枢神经系统(CNS)肿瘤的分类变得更加客观、更依托生物学认知。虽然过去的分子诊断包括特定突变、拷贝数变化或基因融合，但DNA甲基化测序的发展显著提高了诊断精度，增加了可靠性，并为发现新的肿瘤类型提供了思路。在大多情况下，基因突变/融合与DNA甲基化间存在着密切关系。在这篇综述中，作者强调了DNA甲基化图谱在中枢神经系统肿瘤分类中的作用，重点介绍了几种肿瘤类型，以及DNA甲基化图谱对目前肿瘤分类的贡献。

CpG 甲基化测定

有多种方法可以量化DNA甲基化，每种方法在临床肿瘤学中都有不同的应用。限制性内切酶酶切、亲和富集方法，如甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)和电化学检测都是用于测定全基因组甲基化的方法。基因组DNA的重亚硫酸盐测序是最常用的方法，重亚硫酸氢钠可以将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，除此之外还有全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS)技术。图1概述了目前DNA甲基化图谱的诊断应用及其在外科神经病理学中的作用。

生物信息分析

为了将甲基化阵列数据转化为实际应用，需要执行各种分析和计算步骤。用甲基化数据描述肿瘤类型的一个比较常见和实用的方法是降维。类似于主成分分析(PCA)，这些算法将高维数据(例如，数千个脑瘤样本，每个样本具有约20-30k数据)降至低维(2或3)以便于可视化(图2)。

值得一提的是，甲基化阵列数据中还可以获得其他对诊断有帮助信息。人们很早就认识到甲基化和非甲基化信号强度的总和可以用来推断全基因组的拷贝数，分段的拷贝数数据以及拷贝数断裂点的分析也会对诊断和基因融合的判断起到帮助作用。

诊断准确性及其对临床结果的影响

截止到目前，甲基化图谱已经识别出多个新的中枢神经系统肿瘤类型和亚型，其中许多都与临床病程和临床结果有着重要的关联。在临床中，甲基化数据分析在很多病例诊断结果的确定上起到了重要的辅助作用。

基于的临床检测出的差异甲基化数据，从前被归类为原始神经外胚层肿瘤现在被分类成多个不同的肿瘤类型，这些肿瘤包括具有高频率C19MC改变的多层菊形团胚胎性肿瘤(ETMR)，具有 FOXR2 激活的中枢神经母细胞瘤(CNS-NB-FOXR2)，BCOR串联重复的CNS肿瘤(CNS-BCOR-ITD)。总体而言，基于DNA甲基化数据的非监督分析对于CNS-PNET亚型间的区别具有重要的临床意义。

新型和罕见的肿瘤类型

除了在识别常见的中枢神经系统肿瘤类型方面的优势外，甲基化特征分析的一个新的优势是它能够发现新的肿瘤类型，并提供现有类型的确认/改进。例如， IDH1/2 突变定义了一个广泛的弥漫性胶质瘤亚型，这些亚型在临床和分子上与异柠檬酸脱氢酶(IDH)野生型弥漫性胶质瘤不同，这种遗传差异通过DNA甲基化图谱得到证实。甲基化图谱针对对于许多新的肿瘤类型在很大程度上已经成为了一种发现工具。

胶质瘤（Gliomas）

毛细胞型星形细胞瘤(HGAP)包括一个独特的甲基化群，包括 ATRX、TERT 启动子突变； CDKN2A/B 缺失/突变、 CDK4 扩增； NF1 缺失/突变、 BRAF 融合等。组织学表现与其他胶质瘤有很大重叠，HGAP多见于年轻人(中位年龄40岁)，主要见于颅后窝。值得注意的是，HGAP在儿童(0-16岁)中发病是比较罕见的，这个年龄段的大多数形态学诊断的“毛细胞型星形细胞瘤伴间变”与其他甲基化类别聚集在一起，包括毛细胞型星形细胞瘤和IDH-野生型GBM。

目前，甲基化图谱是诊断这种肿瘤类型的唯一方法。在HGAP中发现的基因改变(如 CDKN2A/B 纯合缺失、 ATRX 突变、 BRAF 融合)是非特异性的，可见于其他中枢神经系统肿瘤类型。然而，检测到这些基因改变，就应该引起对HGAP的怀疑。临床上，HGAP与其他高级别胶质瘤的区别很重要，因为HGAP的预后比PA和PXA更具侵袭性，但总体存活率明显高于IDH-野生型GBM。HGAP被误诊为GBM的情况并不少见，精准诊断在临床上具有十分重要的意义，因此将组织学相似的肿瘤分解为生物学和临床相关的类型是DNA甲基化分类的显著优势之一(图3)。

神经胶质瘤（Glioneuronal Tumors）

弥漫性胶质神经元瘤具有少突胶质瘤样特征和核簇(DGONC)是最近提出的一种通过甲基化定义的肿瘤类型，它是通过对>25000个中枢神经系统肿瘤的非监督聚类而发现的。DGONC的组织学表型可能与其他肿瘤类型有显著重叠，包括少突胶质细胞瘤和CNS-PNET。在低级别胶质细胞或神经胶质细胞肿瘤中常见的遗传学改变，如FGFR1和BRAF，尚未在测序病例中发现。由于这种肿瘤类型的遗传驱动因素尚未阐明，DNA甲基化图谱仍然是检测其的唯一方法。在低级别胶质细胞或神经胶质细胞肿瘤中，典型的遗传学改变，如 FGFR1 和 BRAF ，尚未在测序病例中被发现。由于这种肿瘤的遗传驱动因素尚未明确，DNA甲基化图谱仍是其检测的唯一方法。

胚胎肿瘤（Embryonal Tumors）

多层菊形团胚胎性肿瘤(ETMR)是一种高度分级(WHO 4级)的原始中枢神经系统肿瘤，具有明显的组织学特征。ETMR甲基化图谱显示与其他中枢神经系统肿瘤类型明显分离，并形成一个相对同质的群体，无论是C19MC扩增还是 DICER1 突变状态。绝大多数病例存在多层菊形团和神经纤维团混合区域的特征性组织学特征。结合LIN28A免疫组织化学，在显微镜下即可作出诊断。尽管LIN28A具有很高的敏感性，但它的表达不是ETMR所特有的，在AT/RT、生殖细胞肿瘤和HGG中已有报道。因此，DNA甲基化分析是诊断ETMR的一种特异性方法，与潜在的组织病理学或基因突变无关，同时基于甲基化的拷贝数评估也可以作为识别潜在亚型的有用特征。

这些肿瘤类型之间的区别在临床上十分重要，通常可以通过组织病理学和影像学来解决。然而，非典型病例可能会造成诊断困难。AT/RT和PDC(脊椎)的平均OS分别为14.4个月和51个月(AT/RT不同亚型的生存期不同）。CRINET和DMT的生存数据有限，但已报道的平均OS分别为125个月(AT/RT-TYR为37个月)和36个月。尽管有共同的基因改变，AT/RT、PDC和DMT的DNA甲基化特征还是具有明显特异性的(图2)。到目前为止的数据表明，DNA甲基化图谱可以区分可能会构成诊断问题的大多数 SMARCB1 失活的中枢神经系统肿瘤。

间充质肿瘤（Mesenchymal Tumors）

伴有 CIC 基因重排的肉瘤是一种罕见的高级别间叶性肿瘤，同时发生于中枢和中枢神经系统外。在组织学上，伴有 CIC 基因重排肉瘤的特点是肿瘤细胞形态呈梭形或圆形，高度恶性(增殖、坏死)，并有数量不等的粘液基质。特征性的基因改变是 CIC 与各种配对基因的易位，导致作为显性癌基因的融合。在中枢神经系统中，最常见的是 CIC-NUTM1 融合，由t(15；19)易位。在 CIC 融合阳性的病例中，有14%的 CIC 裂解FISH呈假阴性。此外，在融合阴性的病例中也发现了 CIC 突变。最近的一份报告还指出，出现了涉及 ATXN1 和 DUX4 的非 CIC 融合基因。在甲基化图谱上根据 CIC 基因将肉瘤重新分成不同的组，与潜在的融合基因/突变或解剖部位无关(图2)。

DICER1 突变的原发性颅内肉瘤是一种新发现的高度恶性肉瘤，由染色体14q32.13上 DICER1 基因的体细胞或胚系突变所定义。发生在胚系 DICER1 突变背景下的肿瘤可能代表遗传性或综合征性关联(即 DICER1 综合征)。胚胎型横纹肌肉瘤的组织学特征常见于肌源性分化、形态学和免疫表型重叠。因此，初步命名为“具有横纹肌肉瘤样特征的梭形细胞肉瘤， DICER1 突变体”。 DICER1 突变的颅内肉瘤的组织学表现没有特异性，可能与其他肉瘤如滑膜肉瘤、纤维肉瘤和胶质肉瘤重叠。而DNA甲基化分析可以很容易地将 DICER1 突变的原发性颅内肉瘤与其它肿瘤类型区分开来。然而，还需要进一步的研究来评估DNA甲基化分析是否能将其与转移性 DICER1 突变肿瘤区分。

已建立的中枢神经系统肿瘤的表观遗传学亚型

作者在这篇文章中还提供了DNA甲基化图谱对已建立的世卫组织中枢神经系统肿瘤亚型的贡献的例子。世界卫生组织对中枢神经系统肿瘤的第5版分类预计将包括更多分子定义的亚型。甲基化阵列分析已被证明能有效地识别并在某些情况下定义这些亚型。

易基因小结

将DNA甲基化分析整合到中枢神经系统肿瘤的常规检查中，可以提高诊断的准确性以及实现明确肿瘤类型的临床意义。捕捉原发性中枢神经系统肿瘤的遗传异质性是DNA甲基化图谱最大的优势。尤其在组织学上不明确的肿瘤类型中具有重要价值，这些肿瘤类型可能含有靶向改变(例如，IHG)。DNA甲基化在确认组织学诊断方面的可靠性已经得到证实。

在骨骼和软组织病理学中实施的基于DNA甲基化阵列的分类可能预示着其他疾病领域得检测也会发生类似的转变。在通过TCGA分析的33种癌症中，全基因分子图谱显示了基于DNA甲基化数据的无监督聚类的所有类型中具有生物学或预后意义的亚群，进一步强调了DNA甲基化在其他癌症中的潜在临床应用价值。鉴于中枢神经系统肿瘤诊断对甲基化特征的日益依赖及其在临床分类标准中的应用，在诊断神经病理学的实践中，特别是对于罕见的中枢神经系统肿瘤，有必要进一步研究和利用DNA甲基化检测这一对临床诊断有巨大帮助作用的技术。

硫酸二甲酯什么时候与酚反应什么时候与醇反应

最佳答案1、硫酸二甲酯最常用于对酚、胺和硫醇进行甲基化，反应通常以SN2机理进行，且DMS中第一个甲基转移的更快。尽管此类烷基化反应相对高效，硫酸二甲酯的价格也不昂贵，但它的高毒性极大限制了其应用。其他的甲基化试剂中，碘甲烷毒性较低但价格较贵，也可用于O-甲基化。

2、碳酸二甲酯毒性更低，可用于N-甲基化。一般在选用甲基化剂时，需要综合考虑试剂的毒性及反应的效果。1.O-甲基化Me2SO4对酚的甲基化反应是其最广泛的应用。

3、该反应对一些简单的醇也适用，比如硫酸二甲酯与叔丁醇反应，可将其转化为甲基叔丁基醚：2(CH3)3COH+(CH3O)2SO2→2(CH3)3COCH3+H2SO4醇盐也可被甲基化：RO-Na++(CH3O)2SO2→ROCH3+Na(CH3)SO4硫酸二甲酯对碳水化合物的O-甲基化是哈沃斯法（Haworth）测定糖环形结构的基础，一般反应在碱溶液中进行。

WGBS vs RRBS

最佳答案DNA甲基化分析是NGS技术中越来越广泛的一项应用。原因很简单:DNA甲基化是表观遗传修饰的主要机制之一，对基因表达和细胞活性有根本的影响。这是研究细胞发育、转录沉默和发现新的生物标志物的一个有趣的方面。

基于NGS的DNA甲基化分析的目的是研究基因组DNA，发现基因组中单个胞嘧啶或整个区域是否甲基化，因为启动子或gene body甲基化会影响基因表达。典型地，在哺乳动物中，DNA甲基化只出现在CpG二核苷酸上，其甲基化率为70 - 85%，而CpG岛则主要是未甲基化的C以保持活性。顺便提一下:在人类中，大约70%的启动子含有一个CpG岛。

目前有几种研究DNA甲基化的方法，但很少能像亚硫酸氢盐测序(也称为Bisulfite-Seq，BS-Seq或Methyl-Seq)一样提供更好的甲基化状态分辨率。这种方法的关键idea是 将高通量DNA测序的能力与亚硫酸氢钠处理DNA相结合 。当暴露于亚硫酸氢盐中，未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶(包括甲基化的和羟甲基化的)保持不变(图1)。bisulfite处理的DNA测序后，获得的测序reads可以使用专门的比对软件将其比对到原始参考基因组上(图2)（将未甲基化的胞核嘧啶进行转化）。然后，这种比对可以用类似于从NGS数据中检测DNA变异的方式在单核苷酸水平上识别甲基化状态。因此，重要的是要记住 亚硫酸氢盐测序不能区分5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羟甲基胞嘧啶(5hmC) ，即使它们的功能已经被发现是不同的。

最简单的方法是做全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)。但是，你需要足够的read深度来准确的判断甲基化状态。当你要进行的测序是基于一个大基因组（小鼠或人）时，这可能导致测序的成本过高。

作为一种可选方法，你可以把检测DNA甲基化的重点放在基因组的一个特定子集上，从而减少实验的数据量和随后的成本。

一种流行的方法是Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS)。 RRBS的基本思想是获得基因组的“简化表示（reduced representation）” ，重点放在CpG岛上。这包括在裂解阶段添加限制性内切酶来消化DNA。通常， 使用的MspI酶是甲基化不敏感的 。它在5 ' -C^CGG-3 '位点剪切，由于基因组除启动子/CpG岛外，CpGs大量缺失，“简化表示”主要是只捕获这些启动子区域以供进一步分析。消化反应对两端都有CpG的DNA片段和大小不一的片段进行富集。然后填充片段末端并连接adapters。之后选择片段的大小，进行亚硫酸氢盐转换，并进行测序。

与切割同一位点的限制性内切酶有关。上面提到了，对于RRBS，你的序列总是从MspI限制性酶切位点开始，那么当你从那里对片段进行测序时，会得到重复的序列，因为它们总是由那些剪切位点开始的。如果你做了去重，你会把大量有用的reads都删掉了。但是，如果你做的是WGBS（全基因组甲基化测序），你的基因组是在随机的地方被剪切的，那么你就不会得到所有的reads都是相同的开头，除非他们是PCR duplicates。

参考：

1.

2.

3.

甲基电子式是什么？

最佳答案甲基的电子式如下图：

甲基（methyl group），甲烷分子中去掉一个氢原子后剩下的电中性的一价基团。由碳和氢元素组成。甲基作为一个化学基团（-CH），它能够结合在DNA上某些特定部位，这个甲基和DNA结合过程叫甲基化，相反，甲基从DNA上脱落的过程就叫做去甲基化。

相关应用：

1、去甲基化。

由于甲基是合成蛋氨酸、肉碱、肌酸、磷脂、肾上腺素，核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）等具有主要生理作用的物质所必需的基团（Baker等,1985;Frontien等,1994）。

以及甲基化反应在神经系统、免疫系统、泌尿系统和心血管系统中所起的作用，人们认为生长期动物和成年动物都需要稳定的甲基供体。

一般认为动物体内自身不能合成甲基，需要食物中具有富含甲基物质，它们的分子中具有易反应的甲基，从而参与动物生理功能，这类富含甲基的物质称为“甲基供体”,易参与此反应的甲基（即有效甲基),是与氮原子或硫原子连在一起的甲基，象甜菜碱、蛋氨酸、胆碱等（Vogt,1967）。

2、转甲基。

甲基由一个化合物转移到另一化合物上的酶反应：A+B-CH3→A-CH3+B。由于N5、N10-亚甲四氢叶酸的酶促还原作用生成N5-甲基四氢叶酸，由一种钴胺酰胺酶的作用将甲基由N5-甲基四氢叶酸转移到同型半胱氨酸上而生成甲硫氨酸。

内容参考：百度百科-甲基

免疫组化检查和宫颈甲基化检查区别

最佳答案用途不同、检测方式不同。

1、用途不同：免疫组化检查是对组织或细胞内抗原进行定位、定性及相对定量检查，宫颈甲基化检查是用于诊断宫颈癌的早期病变，测出有关宫颈癌的基因突变，为宫颈癌的早期筛查和诊断提供帮助。

2、检测方式不同：免疫组化检查是应用免疫学抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，确定组织或细胞内抗原的位置、性质，宫颈甲基化检查是通过从宫颈组织中提取DNA实现，其中采用高通量测序技术作为基础，可以研究基因的转录变化，筛查出早期恶性肿瘤的突变或基因的表达异常。

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