「山西甲基化筛选」易基因｜全基因组DNA甲基化测序分析全流程

今天运困体育就给我们广大朋友来聊聊山西甲基化筛选,希望能帮助到您找到想要的答案。

本文目录导航：

• 1、易基因｜全基因组DNA甲基化测序分析全流程
• 2、如何查询某个基因片段的甲基化位点
• 3、组蛋白甲基化和乙酰化测序的区别
• 4、为什么Septin9基因甲基化检测不同于其他基因检测
• 5、[甲基化问题锦集]

易基因｜全基因组DNA甲基化测序分析全流程

答全基因组DNA甲基化实验怎么做？从技术原理、建库测序流程、信息分析流程和研究套路等四方面详细介绍。

表观修饰不需要改变 DNA 序列便能实现对性状的改变，表观修饰的改变与基因功能乃至细胞状态、发育、衰老、疾病等存在重要的关联。在众多的表观遗传修饰中，最为重要且研究最为广泛的修饰之一是 DNA 甲基化，而全基因组甲基化测序（WGBS-seq）无疑是最有效的研究手段。

全基因组甲基化测序利用重亚硫酸盐能够将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为胸腺嘧啶 （T）的特性，将基因组用重亚硫酸盐处理后测序，即可根据单个 C 位点上未转化为 C 未转化为 T 的 reads 数目与所有覆盖的 reads 数目的比例，计算得到甲基化率。该技术对于全面研究胚胎发育、衰老机制、疾病发生发展的表观遗传机制，以及筛选疾病相关的表观遗传学标记位点具有重要的应用价值。

全基因组甲基化测序原理示意图入下：

样品检测——样品打断 ——文库构建——BS处理——文库质检

（一）样品检测

对DNA样品的检测主要包括2种方法：

（1）琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解程度以及是否有污染，检测具有明显的主带，且条带清晰；

Qubit 2.0对DNA浓度进行精确定量，DNA检测总量不低于1ug。

（二）文库构建

样本检测合格后，使用Bioruptor系统将1µg样品基因组DNA与未甲基化的lambda DNA混合，然后将其片段化，平均大小约为250bp。片段化后，纯化的随机片段化DNA随后用T4 DNA聚合酶，Klenow片段和T4多核苷酸激酶的混合物进行修复，钝化和磷酸化末端。随后使用Klenow片段（3'-5'exo-）对钝的DNA片段进行3'腺苷酸化，然后与连接5'-甲基胞嘧啶而不是使用T4 DNA连接酶的胞嘧啶连接的衔接子进行连接。完成每个步骤后，使用磁珠纯化DNA。之后，根据说明使用ZYMO EZ DNA甲基化金试剂盒将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。最后，用JumpStart Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，再使用磁珠对PCR产物进行纯化获得最终文库。

（三）文库质检

文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用qPCR方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度> 2nM），以保证文库质量。

（四）上机测序

文库检测合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后在illumina Nova平台测序，测序策略为PE150。

（一）原始下机数据质控

原始下机数据为FASTQ格式，是高通量测序的标准格式。FASTQ文件每四行为一个单位，包含一条测序序列（read）的信息。该单位第一行为read的ID，一般以@符号开头；第二行为测序的序列，也就是reads的序列；第三行一般是一个+号，或者与第一行的信息相同；第四行是碱基质量值，是对第二行序列的碱基的准确性的描述，一个碱基会对应一个碱基质量值，所以这一行和第二行的长度相同。以下为一条read信息的示例：

原始下机数据包含建库时引进的接头序列以及质量过低的碱基，这些因素会导致后续比对到基因组的reads较少，从而导致得到的信息较少，因此需要进行过滤。利用trim_galore软件对原始数据进行去除接头序列及低质量碱基等质控步骤。

（二）序列比对

经过质控的reads需要根据与参考基因组的序列相似度比对到参考基因组上。相比于常规基因组及转录组测序，WGBS测序方法产生的数据的特点决定其在比对时存在三大困难：

（1）DNA片段正链和负链经过重亚硫酸盐转化后将不再反向互补，再经过PCR，便会产生四条不同的序列，这将大大增加比对时的计算量。

（2）经过重亚硫酸盐转化后，DNA序列大部分C碱基被转化成T碱基，因此序列含大量T而缺乏C；经过PCR后，产生的互补链则含有大量A而缺乏G。这样便导致序列的复杂度降低（即序列的组成特征更单一），从而增加比对的难度。

（3）C和T的比对是不对称的。经过重亚硫酸盐转化后，序列中非甲基化的C碱基（占大部分）被转化为T，这将导致测序序列与参考基因组不匹配，T既可能应该比对到T上，有可能应该比对到C上；而C则只能比对到C上。这也增加了比对的难度。

利用BSMAP软件进行比对。BSMAP进行比对时，先以参考基因组上C碱基的位置作为指导，将reads中对应参考基因组C碱基位置的T标记为C，其他T保持不变，从而使reads可以直接比对到参考基因组。

（三）甲基化水平计算

甲基化水平可根据未转化为 T 的 C 与转化为 T 的 C 的 reads 的比例计算得到，即：

Beta-value = C-reads / (C-reads + T-reads) * 100%

其中，Beta-value 即为该胞嘧啶的甲基化水平，C-reads 为覆盖该位点的支持甲基化的reads 数目（测得该位点为 C 的 reads），T-reads 为覆盖该位点的不支持甲基化的 reads 数目（测得该位点为 T 的 reads）。 计算原理示意图如下：

利用BSMAP统计甲基化水平。

（四）差异甲基化区域（DMR）鉴定及统计

DMR检测使用权威期刊发表的metilene软件。该软件先将基因组进行预分段，以排除较长序列中不包含CG位点的片段。随后，利用二元分隔算法，递归缩小检测范围，以搜索得到组间累积平均甲基化差异最大的区域，作为可能的DMR；最后，结合双重统计学检验（MWU-test和2D KS-test），得到准确的DMR。检测原理如下图所示：

本分析检测DMR的标准如下：

（1）区域平均甲基化差异不小于0.1；

（2）CpG位点数不少于5个；

（3）区域长度不小于50 bp；

（4）甲基化水平差异统计检验的校正P值小于0.05；

（5）2D KS-test检验P值小于0.05。

（五）信息分析流程示意图

DNA甲基化组学研究的核心内容在于对DNA甲基化数据的挖掘。DNA甲基化一般遵循三个步骤进行数据挖掘。

首先，进行整体全基因组甲基化变化的分析，包括平均甲基化水平变化、甲基化水平分布变化、降维分析、聚类分析、相关性分析等。

其次，进行甲基化差异水平分析，筛选具体差异基因，包括DMC/DMR/DMG鉴定、DMC/DMR在基因组元件上的分布、DMC/DMR的TF结合分析、时序甲基化数据的分析策略、DMG的功能分析等。

最后，将甲基化组学&转录组学关联分析，包括Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、网络关联等。

Whole-Genome Bisulfite Sequencing of Two Distinct Interconvertible DNA Methylomes of Mouse Embryonic Stem Cells. 两种状态的小鼠胚胎干细胞的甲基化组学研究

1、背景

小鼠胚胎干细胞一般生长在含有血清的基质中，被称作血清干细胞(serum ESCs)；加两种激酶抑制因子使胚胎干细胞在无血清的情况下更能保持多能性的基态，这种干细胞称为2i干细胞(2i ESCs)；这两种状态的胚胎干细胞可以互相转化。以前这方面的甲基化研究大多基于质谱，覆盖度和研究结果有限，尚缺乏2i胚胎干细胞的甲基化组学研究。

2、方法

利用全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS），对这两种可互相转换的小鼠胚胎干细胞进行甲基化组学研究

3、结论

全面准确的检测了两种小鼠胚胎干细胞的DNA甲基化修饰并进行了系统的比较；同serum ESCs相比，雄性2iESCs全局低甲基化；在血清中，雌性ESCs跟雄性2i ESCs类似呈现全局低甲基化，而在2i ESCs状态下，甲基化水平会进一步降低。

就是关于全基因组甲基化测序实验流程和分析思路的介绍。

参考文献：

[1] Ashburner, M. and C. A. Ball, et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nat Genet, 2000, 25 (1): 25-9.

[2] Dirk Schübeler. Function and information content of DNA methylation. Nature, 2015, 517: 321–326.

[3] Frank Jühling et al. metilene: Fast and sensitive calling of differentially methylated regions from bisulfite sequencing data. Genome Research, 2016, 26: 256-262.

[4] Kanehisa M, Goto S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic acids research, 2000,28(1): 27-30.

[5] Tadafumi Kato Kazuya Iwamoto. Comprehensive DNA methylation and hydroxymethylation analysis in the human brain and its implication in mental disorders. Neuropharmacology, 2014, 80: 133-139.

[6] Xiaojing Yang et al. Gene Body Methylation Can Alter Gene Expression and Is a Therapeutic Target in Cancer. Cancer Cell 26, 577–590.

[7] Yuanxin Xi et al. BSMAP: whole genome bisulfite sequence MAPping program. BMC Bioinformatics, 2009, 10:232.

[8] Gao F, et al. De novo DNA methylation during monkey pre-implantation embryogenesis. Cell Res. 2017 Apr;27(4):526-539. pii: cr201725.

如何查询某个基因片段的甲基化位点

答找甲基化位点也就CpG岛一般是有以下几个方法：

1. MSP,亚硫酸氢盐转化后,将你想测的基因区域（如启动子区）转入细菌质粒中,进行测序（金标准）.挑克隆7/10是甲基化的克隆认为这个位点70%甲基化.大概可以测400+片段,但是问题是没有办法太精确,因为测得越多越精确,测太多太贵.

2. 焦磷酸测序,这里指的是Qiagen的PyroMark焦磷酸测序,亚硫酸氢盐转化后,对于启动子片段进行PCR扩增,测序,测出甲基化程度,仪器中Q24有FDA的认证,可以合作开发开发试剂盒.大概可以测60-70bp片段,胜在快速和稳定,但是引物设计成功率不高50%左右,适合小样本.

3. MassARRAY平台进行甲基化检测,用的是质谱法,也是亚硫酸氢盐转化,针对目标片段可以最多到500bp,但是问题是要求样本量一般比较大,位点数*样本数要等于384才好做,至少大于300因为那东西一张片子384,用两次就废了,一周不用完也废了.

4. 甲基化芯片如果你一还没有找到基因那你用这个做个初筛不错.

5. 甲基化测序,这个比较高端,也比较贵,25000一个,一般来说是去筛选未知的一些甲基化位点的方式,全基因组范畴,效果拔群.

组蛋白甲基化和乙酰化测序的区别

答ChIP-seq&mRNA-seq在外周淋巴瘤的药物联用实验中的应用

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上海交通大学附属瑞金医院血液研究所赵维莅教授团队针对外周淋巴瘤的研究。近期，该课题组应用ChIP-seq联合分析揭示了联用西达本胺和地西他滨对组蛋白修饰基因突变的外周淋巴瘤的作用机制。该研究成果于月发表在血液科权威杂志《Haematologica》（影响因子7.7）上。（ChIP-seq及mRNA-seq均由云序生物提供技术服务）

研究背景：

由于不同的形态和免疫特征，约50%的外周淋巴瘤（PTCL）无法分类，并且呈现很差的临床表现，因此迫切需要找到可操作性的生物标志物以便临床上找到更好的治疗策略。已知表观遗传改变在肿瘤发展中起到很关键的作用。组蛋白修饰，尤其是甲基化和乙酰化，一般都会参与调控染色体的状态。在本研究中，作者首先通过靶向测序筛选到一系列组蛋白修饰相关基因的突变，接下来通过ChIP-seq和mRNA-seq进一步分析西达本胺和地西他滨联用对组蛋白修饰基因突变的外周T淋巴瘤的作用机制。

研究思路：

首先，作者筛选到了几个关键基因的突变，比如组蛋白甲基化修饰相关的基因（KMT2D，SETD2，KMT2A和KDM6A）以及组蛋白乙酰化修饰相关的基因（EP300和CREBBP），并在125例患有PTCL患者中发现45例有59个体细胞突变。临床研究发现组蛋白修饰相关基因突变与未经化疗的患者更低的无进展生存期有关，且对组蛋白脱乙酰酶抑制剂西达本胺敏感性增加。

作者发现组蛋白脱乙酰酶抑制剂西达本胺联用低甲基化试剂地西他滨能显著抑制EP300突变的T淋巴瘤细胞的生长以及KMT2S突变的T淋巴瘤细胞的生长。作者进一步通过ChIP-seq和mRNA-seq揭示了联用西达本胺和地西他滨对组蛋白修饰基因突变的外周T淋巴瘤的作用机制（ChIP-seq和mRNA-seq均由云序生物提供技术服务）。地西他滨可协同西达本胺增强KMT2D与转录因子PU.1相互作用，调控H3K4me相关的信号通路，并增强PTCL对西达本胺的敏感性。在KMT2D突变的移植T淋巴瘤模型中，联用西达本胺和地西他滨可显著延缓肿瘤生长，并通过KMT2D/H3K4me诱导细胞凋亡。

1.外周T淋巴瘤突变情况统计

作者招募了239名未经治疗的PTCL患者，并对可获得的125名患者的肿瘤样本进行的靶向测序。作者在125例患者中发现，其中有60例患者一共出现91个表观遗传修饰基因的体细胞突变。大部分突变是错义突变（n=72），还有无义突变（n=10）和移码突变（n=9）。结果表明与其他肿瘤的SNV图谱相似都是更偏向于C>T/G>A突变，这与年龄和性别无关。组蛋白甲基化修饰基因突变发生在KMT2D（编码H3K4甲基化转移酶，25/125，占20%），SETD2（编码H3K36甲基化转移酶，6/125，占4.8%），KMT2A（编码H3K4甲基化转移酶，3/125，占2.4%）和KDM6A（编码H3K27去甲基化转移酶，1/125，占0.8%），并没有EZH2突变。组蛋白乙酰化修饰基因突变发生在EP300（编码H3K18乙酰化转移酶，10/125，占8%）和CREBBP（编码H3K18乙酰化转移酶，5/125，占4%）。还有其他DNA甲基化基因和染色体重构基因突变等。根据突变基因的分类，这四种很少有重叠，尤其是组蛋白甲基化修饰基因突变和组蛋白乙酰化修饰基因突变，这表明组蛋白修饰基因可能在不同的生物学过程中发挥作用。

图一：PTCL突变分类

2.组蛋白修饰基因突变使T淋巴瘤细胞对西达本胺和或地西他滨更敏感

KMT2D和EP300错义突变质粒分别转染至JurKat细胞，发现KMT2D突变会抑制H3K4me3的表达水平，但会被组蛋白脱乙酰酶抑制剂罗米地辛和西达本胺恢复。此外，EP300突变会抑制H3K18ac的表达水平，但会被组蛋白脱乙酰酶抑制剂丙戊酸，亚罗里亚胺酸或罗米地辛和西达本胺恢复。在PTCL肿瘤样本中也发现KMT2D突变显著降低了核内H3K4me3的表达水平（30%），EP300/CREBBP突变也显著降低了核内H3K18ac的表达水平（17%）。有趣的是，给突变患者按每周两次口服30mg的西达本胺，有组蛋白修饰基因突变的复发患者得到完全或部分缓解。这一结果表明这些突变可能使PTCL患者对组蛋白脱乙酰酶抑制剂更敏感。

图示：组蛋白乙酰化抑制剂对KMT2D突变和EP300突变的PTCL的作用

体外实验也进一步证实了这一结论。流式细胞术证明西达本胺和地西他滨可协同诱导KME2D突变的细胞凋亡作用和G0/G1期阻滞作用。在KMT2D突变的移植T淋巴瘤模型中，联用西达本胺和地西他滨还能显著延缓肿瘤生长。体内外实验一致表明联用西达本胺和地西他滨比单用药物作用更显著。

图示：西达本胺和地西他滨对KMT2D突变和EP300突变的PTCL的作用

3.ChIP-seq联合mRNA-seq揭示作用机制

为了搞清楚KMT2D-H3K4me3 DNA结合的靶基因，作者利用ChIP-seq在单用西达本胺或联用地西他滨的KMT2D突变细胞中检测H3K4me3结合的靶基因。Venn图表明联合用药和单用药物中，H3K4me3结合的启动子区域有显著的非重叠区。有趣的是，只有联用西达本胺和地西他滨才能影响H3K4me3结合的基因启动子表达水平，这一结合域的motif富集在与PU.1结合的区域（激活骨髓或B淋巴细胞的基因表达的转录因子）。mRNA-seq也表明与未处理组和单药处理组相比，联合用药参与多种癌症信号通路的调控，包括凋亡，细胞周期调控，细胞粘附和转录调控，而PU.1也参与癌症信号通路和转录调控。作者进一步对联合用药组mRNA-seq和ChIP-seq中重叠的基因进行GSEA分析，结果发现联合用药使MAPK通路去活化，p-ERK也随之调。

图示：ChIP-seq和mRNA-seq揭示西达本胺和地西他滨对KMT2D突变和EP300突变的PTCL作用机制

互联网

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为什么Septin9基因甲基化检测不同于其他基因检测

答2)主动途径:是由去甲基酶的作用,将甲基集团移去的过程。在DNA甲基化阻遏基因表达的过程中,甲基化CpG粘附蛋白起着重要作用。虽然甲基化DNA可直接作用于甲基化敏感转录因子E2F、CREB、AP2、CMycöMyn、NF2KB、Cmyb、Ets,使它们失去结合DNA的功能从而阻断转录,但是,甲基化CpG粘附分子可作用于甲基化非敏感转录因子(SP1、CTF、YY1),使它们失活,从而阻断转录。人们已发现5种带有恒定的甲基化DNA结合域(MBD)的甲基化CpG粘附蛋白。其中MECP2、MBD1、MBD2、MBD3参与甲基化有关的转录阻遏;MBD1有糖基转移酶活性,可将T从错配碱基对TöG中移去,MBD4基因的突变还与线粒体不稳定的肿瘤发生有关。在MBD2缺陷的小鼠细胞中,不含MECP1复合物,不能有效阻止甲基化基因的表达。

[甲基化问题锦集]

答今天和大家聊聊甲基化。

问：什么是表观遗传修饰？

答：基因组表观遗传修饰主要包括DNA甲基化修饰与核小体中组蛋白的修饰等，使得被修饰DNA的空间结构发生改变或使染色体结构发生改变，导致基因的沉默或过度表达。这两种修饰都是在不改变DNA碱基种类与数量的前提下使生物体表型呈现出多样化。

问：什么是DNA甲基化？

答：DNA甲基化是指在DNA 甲基化转移酶的作用下，将甲基选择性地添加到胞嘧啶上形成5’-甲基胞嘧啶的过程。

问：DNA甲基化修饰有什么作用？

答：DNA甲基化是最早发现的一种表观遗传修饰，可能存在于所有高等生物中， 它并不改变基因的碱基序列， 而是通过改变基因的表达影响细胞的功能，与基因沉默、X染色体失活、基因组印记、RNA i以及肿瘤等生物事件密切相关，它们的共同作用机制是调节基因的表达。

问：不同生物，DNA甲基化类型是一样的吗？

答：当然不一样啦。原核生物中甲基化多发生在CCA/TGG和GATC序列，而真核生物中DNA甲基化一般只发生在CpG位点上，哺乳动物DNA甲基化只发生在CpG岛的胞嘧啶，植物甲基化发生在CpG和CpNpG。

问：什么是CpG岛？

答：CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段CpG序列密度很高，可达到均值5倍即所谓的CpG岛。CpG岛主要位于基因的启动子（promotor）和第一外显子区域，约有60%基因的启动子含有CpG岛。CpG岛的GC含量大于50%，经常出现在真核生物的编码基因的调控区。

问：CpG岛为什么要有个"p"，而不叫CG岛？p有什么特殊含意？

答：CpG是胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤的缩写，p代表磷酸。

问：如何预测CpG岛？

答：由于CpG 岛区域较小，研究起来更为方便，因此，众多的研究热点集中在CpG 岛甲基化状态的研究上。而研究CpG岛甲基化的前提条件是确认最合适的CpG 岛区域。

目前有一些网站可以进行CpG岛的预测，我推荐几个比较好用的：

CpG Island（ ）

CpGfinder( )

CpG islands revealing( )

CpGPlot/CpGReport/Isochore( )

然后用实验证实，可以用bisulfite sequencing来比较处理前后的不同，找到甲基化位点。

问：验证特定甲基化位点，并进行甲基化程度分析有哪些方法？

答：采用对照组和实验组样本进行甲基化验证。

(1) MSP方法：可进行特定位点甲基化验证，适用于甲基化芯片后的结果，无法进行甲基化程度分析；

(2) BSP克隆测序法：验证某些相关基因的甲基化位点，并精确计算出甲基化程度百分比；

(3) HRM法：适用于大批量样本甲基化验证，并能计算出甲基化程度范围。

(4) 焦磷酸测序：测序有效长度不超过60bp，精确定量每一个CpG位点。

(5) MassARRAY® 平台：用于单个基因启动子区域的甲基化检测；每个反应覆盖长达500 bp的多个CpG位点； 精准定量每一个CpG位点。

问：刚刚开始研究甲基化，如何寻找甲基化位点？

答：甲基化的研究是近年来较为火热的研究领域之一，您是不是也对它垂涎已久，却苦于无从下手？其实甲基化的研究并没那么难，一句话，还是套路！

首先，甲基化位点的筛选，可以使用全基因组Bisulfite测序（WGBS）、简化基因组甲基化测序（MethylRAD技术）或者甲基化芯片进行基因组整体水平甲基化检测，每种方法各有利弊，要根据实际的研究方向选择不同的方法。对于样品间差异甲基化位点的筛选，可以采用WGBS和MethylRAD技术，其中MethylRAD技术可以应用于无参考基因组的物种，Illumina Methylation EPIC芯片只能用于人类的DNA甲基化水平检测。当然也可以根据一些相关研究显示某些基因存在表达量降低的现象，预测该基因是否存在CpG岛；或者根据文献寻找相关基因的甲基化位点。

其次，对选择的特异位点进行甲基化验证，并进行甲基化程度分析。

最后，根据对照组和实验组样本的检测结果，分析甲基化位点与研究的相关性。

问：只知道基因名称，如何做甲基化检测？

答：只需要将物种及基因信息告知相应或测序公司，会为您提供全方位的检测服务。

原文： 甲基化问题锦集

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