导读免疫组化原理、流程及结果分析 免疫组化原理免疫组化染色是用一抗与被检测组织中目的蛋白抗原结合，然后用HRP等标记的二抗与一抗进行结合，最后通过与DAB显色剂反应，进而确认所...

今天运困体育就给我们广大朋友来聊聊华西甲状腺免疫组化,希望能帮助到您找到想要的答案。

免疫组化原理、流程及结果分析

免疫组化原理、流程及结果分析

免疫组化原理

免疫组化染色是用一抗与被检测组织中目的蛋白抗原结合，然后用HRP等标记的二抗与一抗进行结合，最后通过与DAB显色剂反应，进而确认所要检测蛋白抗原的定位、半定量等目的。

免疫组化更多的意义在于查看目的蛋白的定位。定量一般用western来实现。

免疫组化染色和HE染色的不同之处可能是HE染色比较粗略地辨认不同细胞形态学改变；而后者能够针对特异性细胞标志物来检测特异性细胞的改变（数量）、也可检测细胞内细胞因子的转位，组织中一些特异性蛋白的表达的量改变（通过图像分析系统分析颜色深浅、分布的面积等综合分析）。

通俗的讲，HE仅仅是看大体病理改变，比如组织坏死，比如炎性渗出。免疫组化，看你的目的蛋白的表达情况。

免疫组化和****HE****染色的对比

DAB和HE一样也是一种染色剂，HE染色相对简单，能分辨出细胞中的嗜酸嗜碱性物质；DAB染色全称应该叫做免疫组化DAB染色，经过一系列复杂的生化反应后，DAB(二氨基联苯胺)染色剂能将辣根过氧化物酶染成棕色。

常用的免疫组化染色方法:

组化用HRP的话，信号不够强。通常用生物素标记HRP来增强信号。

1、 ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法）

ABC法是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力特性，与生物素化二抗结合，形成抗原＋特异性抗体＋生物素化二抗＋卵白素＋生物素＋HRP复合物，最后DAB显色。

复合物配制：先将生物素与酶结合，形成生物素化HRP，以生物素化HRP与卵白素按一定比例混合，形成卵白素-生物素-过氧化物酶复合物。

2、 SP法（抗生物素蛋白链酶素-过氧化物酶复合物）

本身没有连接生物素，但有两个生物素亲和力极高的结合位点，可以与二抗上的生物素结合，敏感性高，复合物不需要使用前混合，更为简便。

3、 PAP法

4、 直接法

样本制备

免疫组化结果分析

免疫组化结果的判断原则：

1 、必须设阳性对照和阴性对照。

2 、 抗原表达必须在特定部位。

3 、 阴性结果不能视为抗原不表达。

免疫组化染色实验组与对照组结果分析表

从表可以看出只有6、7实验结果有意义。1-5均因对照组的结果已否定Ab的特异性或IHC技术操作存在错误等而使实验结果失去意义，必须重复实验或换用Ab。

染色失败的几种情况及原因:

1、 所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性对照在内。

2、 所有切片均呈阳性反应。

3、 所有切片背景过深。

4、 阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。

所有切片呈阳性反应，其原因:

1、 切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。

2、 缓冲液配置中未加氯化纳和PH值不准确， 洗涤不彻底。

3、 使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反 应时间过长。

4、 抗体温育的时间过长。

5、 H

2

O

2

浓度过高，呈色过快且粘附剂太厚。

所有切片背景过深，其原因:

1、 内源性过氧化酶没有完全阻断。

2、 切片或涂片过厚。

3、 漂洗不够。

4、 底物呈色反应过久。

5、 蛋白质封闭不够或所用血清溶血。

6 、使用全血清抗体稀释不够。

阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。

最常见的原因:标本固定和处理不当。

注意事项：

1、 苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性染色的位置。

2、 切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，但又防止干片。

3、 以下原因可能导致片子着色不均匀：

①脱蜡不充分。可以60℃烤20min，立即放入新鲜的二甲苯中。

②水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇。

③抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂。④抗体孵育时，切片放倾斜。

⑤抗体孵育后PBS冲洗不充分。

⑥制片厚薄不均匀等问题。

⑦染片盒不平，切片倾斜。

4、 一抗的清洗:

1、单独冲洗，防止交叉反应造成污染。

2、温柔冲洗，防止切片的脱落，推荐用浸洗方式。

3、冲洗的时间要足够，才能彻底洗去 结合的物质。

5、 PBS的PH和离子强度的使用：

1、建议PH在7.4-7.6浓度是0.01 M。

2、中性及弱硷性条件（PH7-8）有利 于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利 于分解。

6、 拍照：

1、有条件的话应该立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。

求免疫组化冰冻切片荧光染色具体流程

wifgw

石蜡切片免疫组化染色步骤

石蜡切片免疫组化染色步骤

1、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下：

1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。

1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。

1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。

2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。

g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10 3、抗原热修复： 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。

3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。

3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。

3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 4、免疫组化染色步骤： （以美国ZYMED公司SP试剂盒为例）

石蜡切片脱蜡至水。

3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。

5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

PBS冲洗，5分钟×3次。

滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。

PBS冲洗，5分钟×3次。

滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。

PBS冲洗，5分钟×3次。

显色剂显色（DAB或AEC）。

自来水充分冲洗，复染，封片。

冰冻切片免疫组化染色步骤

m，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。冰冻切片4~8

免疫组化非特异性染色的消除方法

一、非特异性染色的主要因素

组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点：

（1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去

。

（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。

（3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。

（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。

（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。

（6）荧光素不纯，标本固定不当等。 二、消除非特异性染色的方法

消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种：

（一）动物脏器粉末吸收法

常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加入肝粉50～100mg,在离心管中充分混匀，在室温中振动2h，4℃中过夜，再搅拌10min，高速离心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般应在临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过2周。染色应作吸收前后之比较，吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以免消耗过多的抗体。

肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。

用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据Hiramotos氏等的方法将组织的20%生理盐水匀浆液，用生理盐水洗2～3次，12000r/min

10min离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达到目的，京极方久氏认为这样吸收对荧光抗体几乎没有损失，他们常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用时有必要再吸收一次。

【肝粉的制法】

（1）将若干只小白鼠或大白鼠放血杀死，取出肝脏，用生理盐水洗2～3次，除去血液，剥掉表面的结缔组织的脂肪。

（2）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加生理盐水少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。

（3）将肝匀浆装入离心管内（1/3左右），交换地用2～3倍量生理盐水和丙酮反复洗涤各三次，至上清无血色止，每次完毕先用2000r/min离心沉淀15 min后，再除去上清液。

（4）最后用丙酮洗涤肝浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉淀，将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上，37℃烤干（过夜）。

（5）在乳钵中充分研磨，用120目铜筛筛选过后，分装，密封，低温干燥保存。

2006-12-22 13:24 wifgw

二）透析法

荧光素如FITC分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。

（1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。

（2）浸入0.02mol/pH

7.1～7.4的PBS中（悬于大于标记物体积约50～100倍的PBS内），在4℃中透析，每日更换3～4次PBS，约5～7天，透析液中无荧即可（在荧光光源照射下）。

（三）葡聚糖凝胶G-50柱层析法

除游离荧光素可用2×46cm柱层析法，详细方法参阅第二章。加入荧光抗体15～18ml（按床体积的5%～10%加样），使其缓慢渗入柱内，待即将全部入柱时，加入PBS少许，关闭下口，停留30～40min ，使游离荧光充分进入细筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测F/P比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用20%磺基水杨酸测定蛋白（发生沉淀反应），继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来，至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。

若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类，可先在过柱前透析一夜，否则，NH4+太浓，在蛋白未完全洗脱时即出现NH4+，因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集，之后出现SO4++（用1%BaCl2检查发生白色沉淀）。最后是NH4+，（用纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀），待洗脱液无SO4++及NH4+后可再用。

如仅用小量荧光抗体，可用1×20cm的柱层析柱，取2g Sephadex G-50装柱，即可过滤2～3.5ml荧光抗体。

（四）DEAE纤维素柱层析法

标记过多或过少荧光素的抗体分子可用DEAE-纤维素柱层析法除去。方法如下： DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯IgG方法相同。装柱所需DEAE-纤维素量以干重每克交换20～50mg标记蛋白量为宜

。常用梯度洗脱法如下：

（1）层析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，标记物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据床体积大小每梯度乘3），然后依下列各种离子强度洗脱液，

分别洗脱和收集：

0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/L NaCl）……洗脱部分1。

0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/L NaCl）……洗脱部分2。

0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/L NaCl）……洗脱部分3。

将此三部分收集液（每管5ml）分别测定其F/P比值，0.05mol/L NaCl pH7.2PB洗脱液280nm光密度高峰管合并，浓缩保存备用。因这部分非特异性染色荧光最少，是比较好的荧光抗体。其他两部分可以废弃。

（2）柱上吸附的过度标记蛋白可继续增加NaCl的浓度至

2.0mol/L洗脱完。

经过DEAE-纤维素层析后的标记抗体，其抗体量一般约损失50%，因此有些要求不太高的抗体，如抗细菌荧光抗体，不一定要这样处理，可用染色效价测定的稀释法除去非特异性染色。

（五）荧光抗体稀释法

先测定荧光抗体特异性染色与非特异性染色的效价，若二者效价相差较大，则可将荧光抗体稀释至一临界浓度，使特异性染色呈阳性，而使非特异性染色保持阴性，稀释方法和染色效价测定方法相同。

（六）纯化抗原法

用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价特异性抗体的最主要条件。近代免疫化学技术（免疫吸收法）和柱层析法等提供了很大的可能性，可参考有关专著。

（七）纯化抗体法---免疫吸收法

例如抗IgA血清的纯化方法---免疫吸收法。如分泌型IgA（ SIgA）抗原纯度不高，所制的抗血清常与IgG呈交叉反应，为此需要吸收，常采用纯化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收纯化。方法如下：

1．人IgG聚合物的制备 在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/L pH7.0磷酸缓冲溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，边加边搅，5min即出现混浊，逐现大块胶块，放置30min后，用研钵将凝胶磨细，继用1.0mol/L pH7.0磷酸缓冲溶液反复洗涤3次，末次加蒸馏水至20ml，即为人IgG聚合物悬液。

2．免疫吸收法 将待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物悬液，置室温搅拌60min,离心沉淀，上清液即稀释1倍的纯化抗SIgA血清。如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。

（八）伊文氏蓝（Evans blue）衬染法

用0.01%伊文氏蓝的0.01mol/L pH7.2PBS稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色，呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比，减少了非特异性荧光，宜作常规应用。伊文氏蓝一般先配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀释至0.01%用以

和然释荧光抗体。

此外，还可以用胰酶消化组织切片或用10%牛血清蛋白封闭法等消除非特异性染色，提高特异性染色。

怎样办理华西医院病理会诊

首先带上你的，玻片。蜡块最好也带上，比病理玻片一共有好几张，不要只带一张，这样结果就很模糊，最好全部带上，如果你所在的医院不愿意去不给你，你可以说华西的专家要求全部带上，他就没话说了，然后到门诊上挂病理科的号。随便挂一个老师就好了，他们的会诊会讨论的，特别是针对恶性肿瘤，挂了号后到门诊大楼4楼找病理科，他会给你开一个会诊的导诊单，然后下2楼或者一楼交钱，费用是120元，

病理结果很快就出来了，你可以坐在外面等，另外我可以给你说一位病理专家的电话，因为我也找他看过玻片，不然也不知道

庞教授的电话，02881812647

会诊接待的电话，02885422698

值班医生办公室，02885422701

你最好打庞医生的电话，他人好好的，

免疫组化实验需要几个样本

一、样本种类:

按来源:①组织;②培养细胞

按制作方式:①石蜡片(IHC-P)②冰冻片(IHC-F)③细胞片(ICC)

免疫组化荧光图

二、免疫组化流程图

免疫组化实验步骤解析01

取材

快:尽是半小时内取材完成

准:刀、剪锋利，一步到位，轻夹轻放

大小:1cmx1cmX02cm左右最宜

02固定

何时固定

取材后立刻!马上!用什么固定

4%多聚甲醛或福尔马林较通用，有致志外膜用Canov液，活检用Bouin液

固定液用多少

组织体积20倍最宜。量少应中途换液1-3次固定多久

6-24h最佳。固定后尽快包埋成蜡块(蜡块可保存几年时间而不影响实验结果)，固定越久所需修复强度越大，越容易出现自发荧光及非特异性染色。

03切片

要保存简单 --选石蜡片!要快

--选冰冻片!

要结构漂亮

--选石蜡片!

抗原不稳定 --选冰冻片!抗原稳定

--石蜡片冰冻片皆可!

04烤片切多厚

石蜡片3-8um，一般5um;冰冻片5-15um，一般8um

石蜡片怎么捞片

水温40-45℃组织平整后玻片有油漆的一面贴近组织向斜上方提起

烤多久

37℃过夜或60℃1-2h

注意:使用防脱处理的玻片，冰冻片无需烤片

05

脱蜡至水

Step1:二甲苯(7min)

Step2:二甲苯(7min)

Step3:二甲苯(7min)

Step4:100%酒精(7min)

Step5:85%酒精(7min)

Step6:70%酒精(7min)

注:具体脱蜡时间可结合室温做调整，以组织上的石蜡脱干净为准。

06灭活

①一般组织使用3%HzO2室温孵育10min

内源性过氧化物酶在血管瘤肝胎盘、阑尾炎，坏死区域和急性炎症组织含量较高，这样的组织可以适当延长灭活时间

显色系统为过氧化物酶(HRP)系统，该步骤建议一定要做

碱性磷酸酶(AP)系统以及免疫荧光，该步可以不做

在灭活时，如组织片中出现细小且密集的气泡，表示过氧化物酶含量过高，这时用3%H2Oz溶液难以完全阻断，可以用0.5%高碘酸溶液室温条件孵育10min

07

抗原修复

抗原修复方式:

酶修复、高压热修复、微波热修复。微波热修复一般都能得到很好的效果

修复液的选择:

柠檬酸盐缓冲液(PH60)和EDTA(PH80或9.0)。经验证对于大多数的抗体来说后者使用效果更优

修复强度的选择:

固定时间越久，修复强度越强，旧标本修复强度强于新鲜标本

消化酶的使用:

不同的蛋白有最佳的消化酶，使用中要注意各种消化酶的最佳PH值

8封闭

05%BSA最常用

@血清，效果最全面

封闭血清与二抗同源(比如二抗是山羊抗小鼠gG，封闭液选择山羊血清)，与一抗不能同源09

抗体孵育

0单抗和多抗各有优势，按需选用

一抗4C孵育效果最佳，备选37℃1-2h

二抗需与一抗的种属、类别或亚类相匹配推荐护、山羊、绵羊等种属

0二抗/SABC一般37℃孵育30min10显色

0DAB显色液现用现配②建议镜下控制反应时间

根据显色时间的长短反向优化前期的实验条件

11

复染/返蓝

oMayerS苏木素复染(不易过染)

碱性溶液浸泡返蓝(如氨水、饱和磷酸氢二钠溶液等)

免疫荧光实验可选用DAPI等核染料复染细胞核，无需做返蓝

12

脱水透明

Step1:70%酒精(3min)

Sted2:85%洒精(3min)

Step3:100%酒精(3min)

Step4:二甲苯(3min) Step5:二甲苯(3min) Step6:二甲苯(3min)

注:免疫荧光实验，该步骤可以不做。13

封片

①DAB显色用中性树胶封片

2免疫荧光建议用抗荧光衰减封片剂

AEC显色用水溶性封片剂

免疫组织化学流程

免疫组织化学Protocol

一、灌注取脑

小鼠经左心室灌注（剪切右心耳）37摄氏度40-50ml生理盐水冲洗，4%的多聚甲醛40ml灌注（灌注过程先快，后慢）；

2. 取脑置于4%多聚甲醛溶液中，后固定24小时； 

3. 后固定后经15%蔗糖溶液脱水24小时，再经30%蔗糖溶液脱水48小时脱水；

4. 脱水完成后，将组织放于小盒内，再将其放入液氮的小杯10~20s（组织不接触液氮），取出组织置于-80摄氏度冰箱存储备用，或置于比冰冻切片机中备用。

二、切片

1. 组织从-80°冰箱取出后包埋，置于-20°冰冻切片机里复温；

2. 切取脑片，厚度为10-20μm（切片后不立即染色，必须烘干；可储存于4°冰箱低温冰箱保存）。

三、抗原抗体反应及染色

1. 脑片用PBS漂洗3次*5min（洗去包埋剂）；

2. 用5%H2O2（现配现用）常温避光孵育脑片15 min，PBS再次漂洗3*5min；

3. 封闭：5%血清（或用BSA）室温孵育30 min（血清选择与二抗来源一致），甩去多余液体，不洗；

4. 滴加一抗，置于湿盒中，4℃孵育过夜（或按照说明推荐浓度和孵育条件）；

9. 第二天取出后室温孵育2 h，PBS漂洗3*5min；

9. 滴加二抗，室温孵育2 h（或按照说明推荐浓度和孵育条件），PBS漂洗3*5min；

10. 滴加ABC复合物（4℃ 现配现用）室温孵育2 h，PBS漂洗3*5min；

11. 滴加DAB显色剂（-20°冰箱中提前取出复温）避光反应30 min，PBS漂洗3*5min；

12. 苏木素（可以回收）复染3S后，用自来水漂洗直到干净（至少＞3次）

13. 乙醇梯度脱水 75%（1min）→ 95%（1min）→ 100%（1min）

14. 二甲苯透明（2min）

15. 放在滤纸上，于中心滴上少量中性树脂封片，盖上盖玻片（赶出气泡）（保持水平），置于阴凉通风处保存。（如有多余树脂，可用棉签蘸取二甲苯进行擦洗）

四、图像处理

1.显微镜观察

2.免疫组化图片采用Image-Pro-Plus软件处理，对小鼠海马区域Aβ斑块以及星形胶质细胞进行计数。

                                                 

免疫组化 如何复染（免疫组化，苏木精，盐酸，石

（一）、仪器设备

1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅

（二）、试剂

1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L.

2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g.

3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0，加水至1000ml.

4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0，加水至1000ml.

5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2（pH7.8） 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

7）封裱剂：

a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；

b、油和TBS（或PBS）配制。

8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。

（三）、操作流程

1、脱蜡和水化

脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；

2）无水乙醇中浸泡5分钟；

3）95%乙醇中浸泡5分钟；

4）70%乙醇中浸泡5分钟；

2、抗原修复

用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。

1）抗原热修复

（1）高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。

（2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。

（3）微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。

2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。

3、免疫组织化学染色

SP法

1）脱蜡、水化；

2）PBS洗2～3次各5分钟；

3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；

4）PBS洗2～3次各5分钟； 5）抗原修复；

6）PBS洗2～3次各5分钟；

7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。

8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。

9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。

10）PBS洗3次各5分钟；

11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；

12）II抗中可加入0.05%的tween-20.

13）PBS洗3次各5分钟；

14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；

15）PBS或自来水冲洗10分钟；

16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；

17）自来水冲洗10～15分钟；

18）脱水、透明、封片、镜检。

SABC法

1）脱蜡、水化。

2）PBS洗两次各5分钟。

3）用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。

4）抗原修复。

5）PBS洗5分钟。

6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。

7）滴加Ⅰ抗，室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。

8）PBS洗三次每次2分钟。

9）滴加生物素化二抗，20℃～37℃20分钟。

10）PBC洗3次每次2分钟。

11）滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。

12）PBS洗4次每次5分钟。

13）DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。

14）蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。

15）脱水、透明、封片、镜检。

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